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1、1PD1 基因多态性与自身免疫性甲状腺病的相关性作者：孙燕，朱江，朱本章，张怡，马卫国，何岚【摘要】目的探讨 PD1 基因多态性在西安地区汉族人中的分布及与自身免疫性甲状腺病(AITD)的关系。方法应用 PCRRFLP 方法检测 127 例健康人、125例 Graves 病(GD)患者、117 例桥本氏甲状腺炎(HT)患者 PD1 基因三个单核甘酸多态性位点 PD1.1 、PD1.3 、PD1.5 的基因型。结果发现西安地区汉族人PD1.3 位点不存在多态性；健康人、GD 患者与 HT 患者 PD1.1 、PD1.5 基因型、等位基因频率无显著性差异。结论 PD1.1 、PD1.3 和 PD1
2、.5 基因型不能作为 PD1 基因与 AITD 相关的遗传标志。【关键词】PD1 ；自身免疫性甲状腺病；基因多态性AssociationofPD1genepolymorphismwithautoimmunethyroiddiseaseABSTRACT:ObjectiveToinvestigatetheassociationofPD1genepolymorphismwithautoimmunethyroiddisease(AITD)inHanChineseinXian.MethodsThreesinglenucleotidepolymorphisms(SNP)PD1.1,PD1.3andPD1.
3、5weregenotypedbyPCRRFLPin127healthypersons,125Gravesdiseasepatientsand112Hashimotosthyroiditispatients.ResultsPD1.3wasnonpolymorphisminXianHanChinese.TherewerenodifferencesindistributionandfrequencyofPD1.1,PD1.5genotypesandallelesbetweenhealthypersonsandAITDpatients.ConclusionOurresultsuggestthatPD1
4、genepolymorphismisnotassociatedwithAITD.KEYWORDS:PD1;autoimmunethyroiddisease(AITD);genepolymorphismGraves 病、桥本氏甲状腺炎和特发性甲减被统称为自身免疫性甲状腺病(autoimmunethyroiddisease,AITD)。这是一组由 T 细胞介导的器官特异性自身免疫病。T 细胞活化需要识别双信号系统，即 MHC 抗原肽提供的第一信号和共刺激分子提供的协同刺激信号。共刺激分子中有正性和负性分子之分，二者之间的平衡对自身免疫的启动、发生、发展有重要意义。除CTLA4(cytotoxicT
5、lymphocyteantigen4,CTLA4) 外，PD1(programmeddeath1,PD1) 为新近发现的负性共刺激分子，在多种自身免疫性疾病发生发展中起作用。目前，研究认为 CTLA4 基因是 AITD 的易感基因，PD1 与 CTLA4 同属于 CD28 家族成员。那么，PD1 基因是否也是 AITD的易感基因？关于 PD1 ，Prokunina 首次报道该基因 SNPPD1.3A/G 与系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus，SLE)、类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis,RA)相关1；Nielsen 继之报道 PD1.3 与
6、 1 型糖尿病相关2；台湾地区发现 PD1 基因 SNPPD1.5C/T 与 RA 相关3；香港报告PD1 基因 SNPPD1.1C/T 与 RA 相关4；但国内外文献均无 PD1 基因与 AITD相关性的报道。本研究首次探讨 PD1 基因三个单核甘酸多态性位点2PD1.1 、PD1.3 、PD1.5 在中国人群中的分布及其与 AITD 的关系。1 材料与方法1.1 研究对象对照组：127 名西安地区汉族人，男性 32 人，女性 95 人，年龄(35.613)岁(12-69 岁)，无甲状腺病及其他自身免疫病史，甲状腺功能测定正常。Graves 患者组(GD 组)：125 例 GD 患者，根据临
7、床症状、体征、甲状腺功能测定，血清促甲状腺素受体抗体(TSHreceptorantibodies，TRAb)阳性确诊为GD。男性 36 例，女性 89 例，年龄(34.911.8)岁(14-65 岁)，无其他自身免疫病史。桥本氏甲状腺炎组(HT 组)：112 例 HT 患者，根据临床症状、体征、甲状腺功能测定、血清 TPO 抗体阳性和甲状腺穿刺活检确诊为 HT。男性 21，女性 91例，年龄(34.212.1)(10-68)岁。无其他自身免疫病史。三组年龄、性别差异无统计学意义。1.2 方法1.2.1 基因组 DNA 的提取静脉血 200L，EDTA 抗凝。应用 chelex100 方法提取
8、DNA,chelex100 购自 BioRad 公司。1.2.2PD1.1 基因分型引物：上游 5GATCTGGAACTGTGGCCATGGT3 ，下游 5CCCCCTCTGGGCTCAGGTT3 。PCR 反应体系(20L)：2mix10L，两条引物浓度均为 0.5mol/L，模板 200ng。PCR 反应条件：95预变性 5min进入循环，95变性 15s，67退火 15s，72延伸 15s，共 30 个循环，最后72延伸 10min。PCR 产物长 265bp，含 msp酶切位点作为内对照。30g/L 琼脂糖凝胶电泳确定基因型。AA 基因型酶切产物显示 180、85bp 两条带；AG 基
9、因型酶切产物显示 180、125、85、55bp 四条带；GG 基因型酶切产物显示125、85、55bp 三条带。1.2.3PD1.3 基因分型引物：上游 5TTTTCCTGCATGATCCACTG3 ，下游 5TCTCCTGTCTCCAATGTAAG3 。PCR 反应体系(20L)：2mix10L，两条引物浓度均为 0.5mol/L，模板 200ng。PCR 反应条件：95预变性 5min 进入循环，95变性 15s，57退火 15s，72延伸 25s，共 35 个循环，最后 72延伸 10min。PCR 产物长 386bp，含 pst酶切位点作为内对照。60g/L 聚丙烯酰胺凝胶电泳确定基
10、因型。AA 基因型酶切产物显示 78、308bp 两条带；AG 基因型酶切产物显示 78、98、210、308bp 四条带，GG 基因型酶切产物显示78、98、210bp 三条带。1.2.4PD1.5 基因分型引物：上游 5AGACGGAGTATGCCACCATT3 ，下游 5CACTGTGGGCATTGAGACAT35 。PCR 反应体系(20L)：2mix10L，两条引物浓度均为 0.5mol/L，模板 200ng。PCR 反应条件：95预变性 3min 进入循环，95变性 15s，65退火 15s，72延伸 15s，共 35个循环，最后 72延伸 10min。PCR 产物长 333bp。
11、30g/L 琼脂糖凝胶电泳确定基因型。CC 基因型酶切产物显示 333bp 一条带；CT 基因型酶切产物显示333、326、370bp 三条带；TT 基因型酶切产物显示 263、370bp 两条带。31.3 统计学处理采用 SPSS11.0 医用统计软件包对各组实验数据进行处理。采用 2 检验判断 PD1.1 、PD1.5 基因型是否符合 HardyWeinberg 平衡定律。GD 组、HT 组、对照组间等位基因、基因型频率分布比较采用行列表 2 检验。2 结果2.1PD1.3 多态性分布 PD1.3A 等位基因频率在对照组、GD 组、HT 组均0.05;HTvs.control2=0.33,
12、P0.05allelefrequency:GDvs.control2=0.007,P0.05;HTvs.control2=0.11,P0.052.3PD1.5 基因型与 AITD 的相关性 GD 组、HT 组、对照组间 PD1.5 基因型频率和等位基因频率无显著性差异(表 2)。2.4PD1.1 和 PD1.5 在西安地区汉族人中的分布 PD1.1 和 PD1.5 在病例组与对照组间无显著性差异，合并统计两位点基因型、等位基因频率在西安地区汉族人中的分布(表 3)。2.5PD1 基因单核甘酸多态性等位基因频率在不同人群中的分布西安地区汉族人 PD1.3A 、PD1.5C 、PD1.1A 等位基
13、因频率与其他人种有明显差异(表 4)，表内数字为各等位基因频率。表 2PD1.5 基因型和等位基因频率在病例组和对照组中的分布（略）Table2FrequencydistributionofPD1.5incaseandcontrolgroupsChisquaretest:genotypefrequency:GDvs.control2=0.38,P0.05;HTvs.control2=1.02,P0.05;allelefrequency:GDvs.control2=0.37,P0.05HTvs.control2=0.10,P0.05表 3 中国人群 PD1.1、PD1.5 基因型、等位基因的分布
14、频率（略）4Table3FrequencydistributionofPD1.1,PD1.5inXianhanpopulation表 4PD1 基因单核甘酸多态性等位基因频率在不同人群中的分布（略）Table4DistributionofPD1SNPallelefrequencyindifferentpopulation3 讨论自身免疫性疾病的发生本质是自身反应淋巴细胞克隆得以发育并逃避自身耐受的调控。而 T 细胞耐受的丧失是这一过程的中心环节。近年的研究显示，共刺激分子在其中发挥了重要作用。共刺激分子有正、负之分，正性分子促进 T 细胞的启动、活化，而负性分子则抑制 T 细胞的启动、活化；正
15、、负共刺激分子之间的平衡是调节自身免疫的启动、发生、发展的重要因素。正性分子过度表达或负性分子表达缺陷均可诱发 T 细胞耐受的丧失，而导致自身免疫发生。利用共刺激分子特别是负性分子进行免疫调节为免疫治疗提供了新思路。如利用 CTLA4 分子胞外段与人 IgG 恒定区重组的融合蛋白 CTLA4Ig，模拟 CTLA4 的作用，在动物实验中可减轻自身免疫病如类风湿关节炎、1 型糖尿病、免疫相关性肾病的自身免疫反应。此外，CTLA4Ig 还可诱导移植物免疫耐受。应用抗 CTLA4 的单克隆抗体可以阻断 CTLA4 作用，提高抗肿瘤免疫。但是，单纯利用 CTLA4进行免疫调节并不十分理想，与其他共刺激分子或免疫调节因子联合作用可能发挥更理想的治疗效果。PD1 是新发现的负性共刺激分子，利用 PD1Ig 或抗
