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1、1PDCD5 基因在初诊 Graves 病患者 PBMCs 中表达情况的初步研究作者：金秀平，李明，赵杰，马绍杰，贾伟，陈冬，吴乃君，张秀军【摘要】目的探讨促凋亡基因 PDCD5mRNA 在初诊 Graves 病(GD)患者外周血单个核细胞(PBMCs)中的表达。方法半定量 RTPCR 法检测 53 例初诊 GD 患者外周血单个核细胞 PDCD5mRNA 表达的阳性率和表达水平。结果 35 例 PDCD5mRNA在 GD 患者 PBMCs 中表达呈阳性，阳性率为 66.1%，较正常对照者(55.6%)升高；其表达水平(1.010.13)显著高于正常对照(0.520.13，P0.05)，且 GD
2、 患者高 T3 水平组 PDCD5mRNA 的表达显著高于低 T3 水平组(P0.05)。结论PDCD5mRNA 在 GD 患者 PBMC 表达升高，可能与 GD 淋巴细胞凋亡异常有关。【关键词】PDCD5；Graves 病；凋亡；外周血单个核细胞；反转录 聚合酶链式反应ApreliminarystudyontheexpressionofPDCD5inperipheralbloodmonocytesfrompatientswithuntreatedGravesdiseaseABSTRACT:ObjectiveTostudytheexpressionofPDCD5inperipheralbloo
3、dmonocytes(PBMCs)fromnormalsubjectsandpatientswithuntreatedGravesdisease(GD).MethodsTheexpressionofPDCD5wasassayedbysemiquantitativereversetranscriptasepolymerasechainreaction(RTPCR).ResultsPositiveratewassignificantlyhigherinGDgroups(66.1%)thaninnormaldonorgroup(55.6%)(P0.05).Therelativeexpressionl
4、evelwasalsohigherinGDgroups(1.010.13)thaninnormaldonorgroup(0.520.13)(P0.05).AsignificantlyhigherexpressionofPDCD5wasobservedinGDpatientswithahigherT3levelthanthatinthelowerT3levelpatients(P0.05).ConclusionTheseresultssuggestthatthehigherexpressionofPDCD5mRNAmaybeinvolvedinabnormalapoptosisoflymphoc
5、ytesinGDpatients.KEYWORDS:programcelldeath5(PDCD5);Gravesdisease;apoptosis;PBMC;RTPCRPDCD5(programcelldeath5)即程序性细胞死亡因子 5 是由北京大学人类疾病基因中心从白血病细胞株 TF1 细胞中克隆得到的，是我国拥有自主知识产权的新功能基因，具有促进多种细胞凋亡和抑制增殖的效应。研究发现 PDCD5 在桥本病甲状腺滤泡细胞中阳性表达，而在正常甲状腺细胞中几乎不表达1。PDCD5在初诊未治疗的 GD 患者中的表达情况尚未见报道。为此，我们通过半定量RTPCR 方法测定了 35 例 GD 患
6、者外周血单个核细胞 PDCD5mRNA 的表达情况，并探讨了 PDCD5 的表达与 GD 病的相关性。21 材料与方法1.1 研究对象与主要试剂研究对象：GD 组为目的基因阳性表达的患者 35 例(男 8 例，女 27 例)，平均年龄(40.2014.51)岁，均为就诊于我院内分泌科门诊或病房的患者，均未给予抗甲状腺治疗。依临床表现、甲状腺功能检测结果以及甲状腺核素扫描等临床诊断，确定为 Graves 病。所选对象均为初诊患者，且无其他自身免疫性疾病、肿瘤及内分泌疾病病史。按 T3 水平分为GD1(T34g/L)组 16 例，GD2(T34g/L)组 19 例。正常对照组(NC)18 例，为本
7、院健康查体人员，其中 10 例(男 2 例，女 8 例)目的基因呈阳性表达，平均年龄(38.1011.28)岁。主要试剂：TrizolRNA 提取试剂和 2TaqPCRMasterMix均购自天根生化科技(北京)有限公司，MMLV 逆转录试剂盒购自 PROMEGA 公司。1.2 细胞的分离取研究对象的静脉血，EDTA 抗凝，按常规用 Ficoll 密度梯度离心分离单个核细胞(peripheralbloodmonocytes，PBMCs)。1.3 半定量 RTPCR 检测 PDCD5 基因的表达 mRNA 的提取按 Trizol 总 RNA 分离试剂盒说明书进行。离心收集约 1106 细胞，顺次
8、加入 Trizol 提取液、氯仿、异丙醇提取细胞的总 RNA。紫外分光光度仪分别在 260nm 和 280nm 波长下分析RNA 的吸光值，测定 RNA 的纯度并定量。cDNA 合成按 MMLV 逆转录酶产品说明书推荐的方法。在 0.2mLEp 管中分别加入 2g 总 RNA、Oligo(dT)18、dNTP、5MMLV 逆转录酶缓冲液、DTT、Rnasin、MMLV 逆转录酶和DEPCH2O，反应体系为 40L。逆转录条件为：371h，然后 7210min。PCR 反应：取 2LcDNA，加入 PDCD5 特异性的引物、2TaqPCRMasterMix 和去离子水，反应体系为 50L。PDC
9、D5 引物序列为：上游引物5CAACAGGAAGCAAAGCAC3 ；下游引物为5GATCTTAACTTCTGTCCTAGAC3 ，扩增片段长度为 384bp。以 actin 为内参照，其引物序列为：上游引物 5CCCAGGCACCAGGGCGTGATGGT3 ；下游引物为 5GGACTCCATGCCCAGGAAGGAA3 ，扩增片段长度为 701bp。PCR 反应条件为：943min 预变性，然后 9440s 变性，6145s 退火，7250s 延伸，共35 个循环，最后 7210min 结束反应。将 8LPCR 产物加样至 10g/L(1%)琼脂糖凝胶样品孔中，在 1TAE 电泳缓冲液中电
10、泳鉴定 PCR 产物，紫外灯下观测电泳结果，BIORADGD2000 凝胶成像系统照相记录实验结果，用 QuantityOne 软件测定每个条带的吸光值，并计算样品 PDCD5 条带与内参照 actin 条带的吸光度比值。用相对吸光度单位表示 mRNA 表达量,相对吸光度单位=PDCD5 吸光度单位/actin 吸光度单位100%。PCR 产物的测序与 DNA 同源性分析：为证实PCR 产物确为 PDCD5 扩增片段，对扩增产物进行直接序列测定，将 50L(约5g)已纯化的 PCR 产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行 DNA 序列测定。测序结果应用 BLAST 软件与 GenBank
11、序列进行同源性分析。1.4 统计学处理应用 SPSS11.0 统计软件进行数据统计与分析，各组结果以s 表示，各组之间均数比较用 t 检验，PDCD5 基因阳性率的比较用 2 检验。32 结果2.1 序列测定 PDCD5 基因 PCR 扩增产物进行双向序列测定，经与 GenBank 序列对比，同源性均为 100%，证实 PCR 产物的正确性。2.2 正常人外周血单个核细胞 PDCD5 基因的表达在 mRNA 水平上，用 RTPCR方法研究了正常查体人员 PBMCsPDCD5 基因的表达。结果表明，PDCD5 的 mRNA 在正常人外周血单个核细胞中表达的阳性率 55.6%，表达量平均为 0.5
12、20.13。2.3Graves 病患者外周血单个核细胞 PDCD5 基因的表达 35 例 GD 患者PDCD5mRNA 呈阳性表达，表达阳性率为 66.1%，其平均表达强度为 1.010.13，经 2 检验，正常对照组与 GD 组 PDCD5 阳性率无统计学差异。经 t 检验，外周血单个核细胞 PDCD5mRNA 的表达强度在 GD 组显著高于正常对照组(1.010.13vs.0.520.13,P0.01)。2.4GD 患者不同 T3 浓度组甲状腺功能的测定、血清 TRAb 与 PDCD5mRNA 的表达高 T3 组血清 TRAb、T4、FT3、FT4 高于低 T3 水平组(P0.05)。高
13、T3 组外周血单个核细胞 PDCD5mRNA 的表达强度为1.260.43，显著高于低 T3 水平组该基因表达的强度(0.940.33，P0.05，表 1)。表 1GD1 组和 GD2 组甲状腺功能水平与 PDCD5mRNA 的表达水平的比较（略）Table1ComparisonofPDCD5mRNAexpressionandglandulathyreoidenfunctionallevelineachgroup*P0.05vs.GD1group3 讨论PDCD5 又称为程序性细胞死亡因子 5，其基因定位于 19q12-q13.1，由 6 个外显子和 5 个内含子组成。PDCD5 有促进多种细
14、胞凋亡和抑制增殖的效应,不仅在细胞凋亡时表达增加，而且凋亡早期就出现明显的核转位现象2。该因子可与 Caspase3 特异性结合，提高 Caspase3 蛋白的活性3。单独存在时不具备诱导凋亡的作用，但与其他凋亡诱导剂同时存在时则可明显促进凋亡进程。GD是一种器官特异性自身免疫性甲状腺病。其发病主要是由于致敏淋巴细胞产生的TRAb 作用于甲状腺滤泡细胞产生大量的甲状腺激素引起，自身反应性淋巴细胞的活化及其与共刺激分子 CD40/CD40L、ICOS/GL50 等的相互作用是该病发展过程中的启动环节。关于 GD 外周血单个核细胞凋亡情况的报道较少。我们研究PDCD5 基因在外周血单个核细胞的表达
15、情况尚属首次。CebrianM 等4认为未治疗的 GD 患者外周血 T 淋巴细胞表达 HLADR,CD25 和 CD69，表明淋巴细胞浸润甲状腺组织之前已经在外周活化。自身免疫反应过程不仅局限于甲状腺，有 50%以上的 GD 患者合并甲状腺相关性眼病5，还有部分患者合并皮肤受累。所以，我们选择了外周血单个核细胞作为研究对象。细胞凋亡在维持组织的自身平衡、控制异常细胞的生长以及调节免疫反应中起重要作用，是限制外周循环中自身反应性 T 细胞过度增殖的重要方式。破坏细胞凋亡平衡将会引起自身免疫的紊乱，4引发自身免疫性疾病。GD 外周血淋巴细胞凋亡的机制复杂，涉及多种凋亡相关因子。Feldkamp6研
16、究了包括 112 名 GD 患者在内的甲亢患者，发现其血清中可溶性 Fas(sFas)水平增高，经抗甲状腺药物治疗甲状腺功能正常后 sFas 恢复正常。Maruoka7认为在病情严重的自身免疫性甲状腺病患者外周 T 淋巴细胞 Fas表达增高。本研究中，GD 患者外周血淋巴细胞 PDCD5mRNA 的表达显著高于正常对照者。表明 PDCD5 可能是继 Fas、Bcl2 和 TRAIL8等经典凋亡途径之后又一新的影响 GD 免疫细胞凋亡平衡的因子。Shoji 等9用 T3 和 T4 培养的正常人外周淋巴细胞及 T 淋巴细胞系发现其表达抗凋亡蛋白 Bcl2 减少。推测虽然外周血促凋亡因素与抑凋亡因素均发生了改变。但是，自身反应性淋巴细胞能抵抗细胞凋亡的发生。该研究还发现随 T3 浓度升高，淋巴细胞凋亡数也随即增加，同时他们还观察到
