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1、第三讲 细胞相关生物学行为 分析方法 Methods for the research of cell behaviors,一、细胞增殖(proliferation)动力学检测方法 二、细胞凋亡(apoptosis)检测技术 三、细胞侵袭/迁移(invasion/migration)检测技术 四、细胞生物力学特性(biomechanics)检测技术,一、细胞增殖动力学检测方法,培养中，细胞的生长、繁殖(proliferation)和死亡(death)是一个动态的过程，细胞增殖动力学是描述细胞状态的一项重要指标。,(1)生长曲线(growth curve)的测定：记录细胞的绝对生长数值，了解细胞
2、总体的(global)增殖生长规律。 (2)分裂指数的测定：记录细胞群体中分裂期细胞(cell at mitotic phase)所占百分比，用以表示细胞增殖旺盛程度。 (3)细胞增殖指数：新增殖(newly generated )的细胞占细胞总数的百分比。 (4)集落（克隆）形成实验：测定单个细胞(single cell)增殖能力。,一、细胞增殖动力学检测方法 (1)生长曲线的测定,对比生化、物理刺激、基因改造前、后细胞生长特性的差异,反映细胞生长特性：对数生长期（传代）、倍增时间(doubling time)等,在培养瓶或孔板中准确接种相同数量的细胞，每天计数(count everyday
3、)，测出培养瓶或孔板中的细胞总数，持续7天（也可根据需要而定）。细胞接种量以7天能长满，而不发生接触抑制(contanct inhibition)为度。,一、细胞增殖动力学检测方法 (1)生长曲线(growth curve)的测定,血球计数板,Tips: (1)数上不数下，数左不数右； (2)每一大方格细胞数104=细胞数/mL (3)可用台盼蓝(trypan blue)染色区分活、死细胞,细胞计数法(cytometry),0.01cm20.01cm=0.1mm3,一、细胞增殖动力学检测方法 (1)生长曲线的测定,原理：活细胞线粒体(mitochondrion)中脱氢酶(dehydrogena
4、se)能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物甲臜（formazan)，并沉淀在细胞中。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。用酶标仪(microplate reader)测定OD值即可获得间接的细胞数量表征。 特点：快速，准确，可一次处理多个样品。由于脱氢酶非细胞数量的直接表征，常被审稿人诟病。 类似方法：WST、MTS、XTT、CCK8等。,MTT（四唑盐）法,酶标仪,摇床,96孔板,一、细胞增殖动力学检测方法 (1)生长曲线的测定,XTT法原理：XTT是异种与MTT类似的四唑氮衍生物，可被活细胞线粒体脱氢酶还原成水溶性的棕色(bro
5、wn)甲肷产物，当XTT与电子耦合剂（PMS）共同使用时，甲肷的生成量与细胞的增殖程度呈正相关。 MTS法原理：与MTT法原理类似。MTS是MTT的类似物，能被活细胞线粒体中脱氢酶还原成可溶于水的有色产物甲臜盐，可直接进行比色。特点：步骤相对MTT更简单，相对更准确。 WST-1法原理：与MTS原理类似。检测范围宽于MTT和MTS。 CCK8法原理：基于WST-8。在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物。颜色的深浅与细胞的增殖成正比。使用酶标仪在450mM波长处测定OD值，间接反映活细胞数量。,一、细胞增殖动力学检测方法 (1)生长曲线的测定,各
6、种细胞增殖/毒性检测方法的优势比较,一、细胞增殖动力学检测方法 (2)分裂指数(mitotic index)测定,于细胞培养载玻片上进行，定时取出玻片进行固定染色，并观察计数，也可将数据绘制成曲线。,细胞培养载玻片,骨髓细胞Giemsa染色,细胞分裂过程荧光染色,一、细胞增殖动力学检测方法 (3)BrdU掺入法测定细胞增殖指数,5-溴脱氧尿嘧啶核苷是胸腺嘧啶的衍生物，可以通过与胸腺嘧啶竞争掺入到S期细胞单链DNA中，再利用抗BrdU单克隆抗体显示增殖细胞核。通常用DAPI和BrdU荧光染色复染的方法来分析细胞的增殖情况。 BrdU competes with thymine in the sy
7、nthesis of DNA during proliferation.,Anti-Brdu DAPI,BrdU掺入法根据选择抗体标记物的不同，还可以通过免疫组化(IHC)、流式细胞术(FACS)、ELISA检测细胞的增殖情况。 同类方法：EdU法,一、细胞增殖动力学检测方法 (4)集落形成(colony forming)实验,单个细胞在体外持续生长，其后代所形成的细胞群称为克隆或集落。该方法可对单个细胞的增殖潜力做定量分析，也常用来确定抗癌药物对肿瘤的杀伤能力。常用的方法包括平板集落形成实验（贴壁细胞）和软琼脂集落形成实验（悬浮细胞）。,CFU-E,CFU-GM,一、细胞增殖动力学检测方法
8、(4)集落形成实验,结晶紫染色 Crystal violet,二、细胞凋亡(apoptosis)检测技术,细胞死亡有两种不同形式，即细胞坏死(necrosis)和细胞凋亡(apoptosis)。细胞坏死是由外界因素导致的细胞急速死亡；凋亡是细胞在生理(physiological)或病理(pathological)条件下由基因(gene)调控的死亡过程。细胞凋亡过程中膜结构完整(integral membrane)，染色体DNA断裂(DNA fragmentation)，细胞膜包裹这核碎片形成凋亡小体(apoptosis body)。 凋亡在胚胎发育、成年阶段衰老、病变细胞的清除发挥着重要的作用
9、，也是研究药物作用机理和进行药物筛选的的重要手段。,常用检测方法： 1. 形态观察(morphology) 2. DNA琼脂糖凝胶电泳(electrophoresis) 3. MTT细胞活性检测 4. 流式细胞仪分析(FACS) 5. 原位末端标记（TUNEL）,二、细胞凋亡检测技术 (1)形态观察,可通过HE染色，Giemsa染色等方法观察凋亡细胞染色质浓缩，凋亡小体等现象，也可用电镜、荧光显微镜观察细胞凋亡。,电镜观察细胞超微结构,Hoechst33258染色细胞核观察凋亡,二、细胞凋亡检测技术 (2)DNA琼脂糖凝胶电泳 agarose electrophoresis,细胞凋亡最突出的生
10、化特征是由凋亡引起的核酸内切酶(endonuclease)的活化，使染色质核小体(nucleosome)间连接断裂，DNA裂解为长度为180200bp及其倍数的片段，在琼脂糖凝胶电泳上呈现DNA梯形电泳图谱。,二、细胞凋亡检测技术 (3)凋亡细胞原位末端标记法（TUNEL）,凋亡细胞染色体DNA的断裂首先降解为50300kb的大片段，然后在核小体间随机断开，形成180200bp的小片段。脱氧核糖核酸末端转移酶（TDT）的作用下，生物素或荧光素标记的dUTP可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH端，通过颜色反应，特异准确的定位凋亡细胞。,优点：是分子生物学和形态学相结合的方法，并可检测出早
11、期和极少量的凋亡细胞，灵敏度比DNA Ladder法高。,二、细胞凋亡检测技术 (4)流式细胞仪检测凋亡（PI单染色）,溴化丙锭（propidium iodide, PI）可与细胞内DNA结合，流式细胞术检测到的PI荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。凋亡细胞由于总DNA量降低，将于正常G1/G0期细胞群前出现一亚二倍峰，即凋亡细胞群。,G1/G0期：正常细胞（2N）； G2/M期：分裂的细胞（4N）； S期：细胞DNA含量介于前两者之间。,缺点：无法区分死细胞与凋亡细胞，对早期凋亡也无法检测。,二、细胞凋亡检测技术 (4)流式细胞仪检测凋亡（AnnexinV-PI双染色）,磷脂酰丝氨酸
12、（phosphatidylserine，PS）分布于细胞内膜，凋亡细胞PS外翻。Annexin V是一种磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。,三、细胞迁移/侵袭检测技术,细胞迁移（migration）和侵袭（invasion）的概念最初来自于肿瘤学。侵袭是指恶性肿瘤细胞从起源部位沿组织间隙向周围组织浸润的过程，其标志是肿瘤细胞突破基底膜。肿瘤侵袭是肿瘤细胞与周围间质相互作用的结果。 细胞侵袭的研究侧重于细胞与胞外基质（ECM）的相互作用。,三、细胞迁移(migration)/侵袭(invasion)检测技术,细胞迁移是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的浓度梯度后产生的移动。过程中细胞不断
13、向前方伸出突足(pseudopodium)，然后牵拉胞体的循环过程。细胞骨架(cytoskeleton)和其结合蛋白(binding proteins)是这一过程的物质基础，另外还有多种物质对之进行精密调节。 细胞迁移侧重于研究细胞的趋化性(chemotaxis)和运动性(motility)。,三、细胞迁移/侵袭检测技术 (1)Transwell 法检测细胞迁移,Transwell chamber也叫做通透性细胞培养支持物，0.1m孔径的膜主要应用于药物转导研究，细胞迁移、侵袭、趋化性和运动性研究通常采用3.0m以上孔径的膜。一般迁移/侵袭实验使用8m直径的膜。 实验结束后采用结晶紫(crys
14、tal violet)或DAPI等染色观察迁移细胞数目。,control 0.1 g/ml 0.5 g/ml 1 .0 g/ml OPN,三、细胞迁移/侵袭检测技术 (2)划线法检测细胞迁移,划线法又叫做wound healing法，是体外模拟体内伤痕愈合过程的实验方法。,三、细胞迁移/侵袭检测技术 (3)Transwell法检测细胞侵袭,基底膜(basement membrane)是普遍存在的一种连续的细胞外基质成份构成的膜性结构，主要含层粘连蛋白(laminin)和胶原(collagen)。局部蛋白质水解导致基底膜降解有利于肿瘤细胞的穿出。常用的人工基底膜材料为Matrigel。,三、细胞
15、迁移/侵袭检测技术 (4)微流控法检测细胞迁移、侵袭,VEGF诱导内皮细胞迁移 Migrating cells into soft (pH 7.4) and rigid (pH. 11.0) scaffolds were studied. Cells were stained for actin by Rhodamine-phalloidin (yellow) and nuclei by DAPI (blue).,共培养条件诱导内皮细胞迁移 MTLn3： GFP-expressing rat mammary adenocarcinoma cells (乳腺癌细胞) U87MG： GFP-exp
16、ressing human glioblastoma cell line （胶质瘤细胞） 10T ： Mouse smooth muscle precursor cells （平滑肌祖细胞）Cells were stained for actin by Rhodamine-phalloidin (yellow) and nuclei by DAPI (blue). HMVEC （内皮细胞）were stained for vWF(green) to distinguish them from 10T 1/2.,四、细胞生物力学特性检测技术 (1)微管吸吮技术(Micropipette Aspiration Technique, MAT),原理：采用微管吸吮方法捕获表征特异性相互作用分子的细胞或小球，通过压电晶体驱动器操控微管，实现两细胞或小球间靠近-接触-回拉的动力学循环，并记录回拉过程中细胞变形与否、变形大小和解离时间长短等信息来研究分子间相互作用(interaction between molecules)的动力学性质。,优
