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1、三维细胞培养技术的简介,闫辉 2014.10.9,目录,1 三维细胞培养技术的概念 2 三维细胞培养技术产生的背景 3三维细胞培养技术的亮点 4 三维细胞培养模型的建立 5 三维细胞培养技术的应用 6 三维细胞培养技术的发展前景,1 三维细胞培养技术的概念,三维细胞培养技术( three-dimensional cell culture,TDCC) 是指将具有三维结构不同的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养, 使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长, 构成三维的细胞载体复合物。三维细胞培养是将细胞培植在一定的细胞外基质中,细胞外基质（ extracellular matrixc，)
2、（1）蛋白充当生长支架,使得细胞能够分化产生一定的三维组织特异性结构,所创建的细胞生长环境,则最大程度地模拟体内环境。,2 三维细胞培养技术产生的背景,细胞的体外培养,关注的不仅仅是它们的分裂生长,而更为重要的是它们经过传代后能否维持体内的性状。在很多情况下,单层细胞培养技术所取到的研究结果和体内的情况不符合,因为细胞在体外改变的环境下增生,逐渐丧失了原有的性状。动物实验完全在体内进行,但由于体内的多种因素制约以及体内和外界环境相互影响而变得复杂化,难以研究单一过程。,另外,我们在动物身上所观察到的结果,往往是最终呈现的表现,而非研究者最为关心的中间过程。显然,如何填补单层细胞培养和动物实验的
3、鸿沟,一直是生命科学家思索的问题。尤其是在发育生物学领域,迫切需要建立一套细胞培养技术,既能生长传代,还能最大程度地维持体内性状,并分化产生新的组织结构,以便全面研究发育过程。随着组织工程的新兴发展,三维细胞培养技术就应运而生了。,3 三维细胞培养技术的亮点 三维培养体系为细胞提供类似体内生长环境的支架或基质，细胞通过紧密连接和/或缝隙连接等连接方式建立细胞间及细胞与胞外基质间的联系，形成一定的三维结构； 三维培养细胞在基因表达、基质分泌及细胞功能活动等方面与单层培养均有明显差异，而与体内细胞生长情况更为相似；因此，三维细胞培养既能保留体内细胞微环境的物质结构基础，又能体现细胞培养的直观性及条
4、件可控制性，把体外无细胞及单层细胞培养体系与组织器官及整体研究联系起来。,4 三维细胞培养模型的建立,4.1三维基质胶（2）的种类以及常用基质胶的介绍 4.2三维模型的种类 4.3常见三维细胞培养模型的建立方法,4.1.1目前已经知道的基质胶主要有海藻酸钙凝胶、琼脂糖凝胶，这两种凝胶主要适用于悬浮细胞的培养，还有一种是血纤维蛋白，将动物细胞和血纤维蛋白原混合，然后加入凝血酶。凝血酶将血纤维蛋白原转化为不溶性的血纤维蛋白，将动物细胞固定在其中。血纤维蛋白可以促进细胞贴壁，因此无论是悬浮细胞还是贴壁细胞都适合。,4.1.2实验室大量使用的基质胶是Matrigel胶，是从小鼠肿瘤组织中提取的抽提物，
5、在室温下，Matrigel可自动聚集产生类似于哺乳动物细胞基底膜的生物活性基质材料。Matrigel 基底膜基质形成的三维培养基质，可促进上皮细胞、肝细胞、Sertoli细胞、黑色素瘤细胞、血管内皮细胞、甲状腺细胞及毛囊细胞等的贴壁与分化。同时，Matrigel还能影响乳腺上皮细胞的蛋白表达，支持外周神经的新生和牛输卵管上皮细胞的分化。高浓度的Matrigel适用于研究体内血管生成和肿瘤细胞迁移及肿瘤模型的建立等。,4.2三维细胞培养模型的种类,三维立体培养的方法有多种，常用的有胶内培养模式(细胞与胶原胶混合)、胶上培养模式(细胞生长于胶原胶表面)和三明治培养模式(细胞生长于两层胶原中间)。,
6、4.2常见三维细胞培养模型的建立方法,4.2.1胶内培养模式的建立方法 Matrigel母液浓度10.6 mg/mL（3）,放置于4溶解(4)。消化细胞,重悬至完全培养基中计数,细胞悬液浓度为1106/mL。使用时置于冰上,用预冷的细胞重悬液与Matrigel等体积混匀,24孔板中每孔加入100l。37放置30 min使其成胶,添加完全培养液。置于375%CO2细胞培养箱中孵育,第二日换液,此后每隔一日换液一次1。,4.2.2胶上培养模式的建立方法 在24 孔培养板中每孔加入75 l冰上过夜解冻的Matrigel，置于37孵箱中 孵 育15min以上使Matrigel 聚集。同时胰酶消化常规培
7、养的正常鼻咽细胞及其高转移潜能亚株5-8F, 计数后离心收集细胞.然后把细胞悬浮于含2%Matrigel的Keratinocyte-SFM培养液中，细胞浓度为2*104/ml用 加样枪吹打成单个细胞后, 每孔加入400 l 细胞悬液于已经凝固的Matrigel上，置于含5%CO2的37孵箱中培养，每3-4 天换新鲜培养液2。,4.2.3三明治培养模型的建立方法 三明治模式前期工作和凝胶上模式相同,不同之处在于凝胶上的细胞经培养融合至(70、80)%左右时,吸去培养液,用无菌PBS冲洗两次后添加第二层胶(200l/孔),在37下培养30min使其凝固后,再在胶原凝固面上添加培养液3。,三种模型的
8、简单解释,4.3不同模型的比较,对于胶上培养模式，细胞可以黏附于细胞外基质表面并向再造基质胶中生长，但是只有贴近 Matrigel 胶的细胞才能得到固体细胞外基质的支撑，其他不能贴近再造基质胶的细胞仍然处于 2D 培养条件下，在培养过程中不能形成完全的立体克隆；对于胶内培养模式，细胞直接重悬于完全融化的 Matrigel 胶条件下，细胞生长于完全固态的细胞外基质中，可以很好地模拟体内肿瘤细胞生长微环境，在培养过程中形成了巨大的、无极性的球状细胞克隆。所以大多数的实验建立三维模型采用胶内培养模式，但相对来说胶上培养模式简单一些，对于操作的要求低一些。三种模型共同的缺点是无法对细胞直接利用显微镜进
9、行连续的观察，需要对某一特定时间的胶原块进行固定制作电镜标本。,B C,A 2D细胞培养模型 B细胞生长于 Matrigel 胶表面 C细胞重悬于 Matrigel 胶中 4,5三维细胞培养技术的应用,5.1肿瘤生物学 三维细胞培养已被广泛运用到肿瘤学研究,在肿瘤的实验性治疗、肿瘤的侵袭性、转移和中心坏死的机制、肿瘤的血管形成和营养供给、体内基因表达的模拟等方面发挥了不可替代的作用5。同时可以研究不同细胞间的相互作用，观察两种不同的细胞类型是否融合或是不相关地各自生长,5.2软骨和骨组织 成熟的软骨细胞和干细胞被广泛用于三维细胞培养,以再生损伤的软骨、骨、韧带、肌腱和膝关节半月板。在培养系统中
10、常加入一些生长因子,以刺激分化,产生组织. 5.3循环系统和心脏 各组织都配备有大小各异的血管。如何在成熟的组织中及时产生血管网络是组织工程的重要课题;在治疗领域,所关心的也是如何有目的地改变血管形成,利用三维培养可以清楚地观察到细胞通过空间增殖、迁移和锚定,最终形成管状结构。,6三维细胞培养技术的发展前景,近年来,三维细胞培养作为一项新兴的细胞培养技术,其与二维细胞培养中细胞的平面生长相比,最大的优势在于提供了一个三维的立体微环境,细胞在这个微环境中完成增殖、分化、运动、凋亡等等一系列过程,很大程度上模拟了人体微环境中的细胞状态,因而具有极大的可开发性。,尤其是在抗肿瘤研究领域,模拟肿瘤微环
11、境,关注肿瘤细胞外基质在肿瘤发生发展过程中的作用成为了一个热点话题。三维细胞培养技术,恰恰为肿瘤细胞的生长提供了与人体相一致的微环境,因而在为抗肿瘤治疗寻找新靶点等方面具有不可替代的价值,值得进一步的开发和利用。但是必须承认,目前的三维培养技术仍然有待发展,一方面其成本仍较高,另一方面由于培养条件尚处于亚最佳状态,细胞的生存能力和分化程度有限,与真实人体尚存在差异,所以如何通过技术上的继续完善使培养条件尽可能地模拟体内,是摆在研究人员面前的重要任务。,注释,（1）细胞外基质由细胞分泌到细胞外间质中的大分子物质，构成复杂的网架结构，支持并连接组织结构、调节组织的发生和细胞的生理活动。在生物学中，
12、细胞外间质或细胞外基质是动物组织的一部分，不属于任何细胞。细胞外间质决定结缔组织的特性，对于一些动物组织的细胞具有重要作用。它决定结缔组织的特性，为细胞的生存及活动提供适宜的场所，并通过信号转导系统影响细胞的形状、代谢、功能、迁移、增殖和分化，主要成分包括糖胺聚糖、蛋白聚糖，结构蛋白，粘着蛋白。,（2）基质胶可认为是一种可溶性的基底膜基质。主要成分包括：层黏连蛋白、胶原IV等，同时含TGF-成纤维细胞生长因子、组织纤维酶原活化因子以及其它在EHS肿瘤中自然表达的生长因子等。 （3）三维胶的最终浓度，需要根据实验条件进一步的确定，浓度的高低不仅影响到凝胶的时间，同时影响到细胞在胶内存在的状态。
13、（4）Matrigel在22-35温度环境下快速成胶，因此溶解时在4冰上过夜冻融（4度时会随着温度的上升部分成胶）。所有用品在使用前需置于冰浴，必须使用预冷的移液管、吸头及小管操作Matrigel。成胶后的Matrigel可以在42448小时后重新呈液态。 (5) Matrigel基底膜基质在室温条件下，聚合形成具有生物学活性的三维基质，模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能,基底膜是细胞外基质特化而形成的一种柔软、坚韧的网膜结构。,参考文献,1冯志华,米坤. Matrigel胶的肺腺癌细胞株A549体外三维培养的实验研究J.西部医学,2009,21(9): 2廖雯婷,汪慧民,李满枝等.鼻咽癌变不同时期的体外三维培养模型建立的实验研究J.Chinese Journal of Cancer,2005, 24(11):1317-1321. 3王铭洁,蔡文杰,姚泰,朱依纯.血管内皮细胞和心脏组织块的立体培养J.生理学报,2005,57(2):259一269. 4吴亚妹.体外三维培养条件下肝癌细胞侵袭、转移的实验研究 J. 5杨志林,徐如祥.三维细胞培养在肿瘤研究中的进展J.国外医学肿瘤学分册,2001,28(2):100-104.,谢谢观赏,
