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1、检查高分子杂质的意义,内酰胺抗生素是临床上常用的药物之一。同时也是较易发生不良反应的药物之一。在临床上最常见的不良反应是速发型过敏反应。引发内酰胺抗生素速发型过敏反应的过敏原并不是内酰胺抗生素本身,而是其中存在的高分子聚合物。在六、七十年代就报道内酰胺类抗生素溶液在室温下放置几天产生聚合物,其具有强的抗原性质,在临床过敏反应中起重要作用。经近几十年的研究也证明抗生素所致的过敏反应抗生素是由其中存在的高分子聚合物产生的,高分子杂质的含义及分类,1.含义：高分子杂质：高分子杂质是对药品中分子量大于药物本身的杂质总称。它可能是聚合度不同的多组分混合体。 2.分类：抗生素药物中的高分子杂质按其来源通常
2、分为外源性杂质和内源性杂质: （1）外源性杂质包括蛋白、多肽、多糖等类杂质,或抗生素和蛋白、多肽、多糖等的结合物,外源性杂质一般来源于发酵工艺; （2）内源性杂质系指抗生素药物自身聚合产物,聚合物可来自生产过程,又可在储存中形成,甚至在用药时也可由使用不当产生。,三种主要分离模式,抗生素聚合物的免疫原性通常较弱,但作为多价半抗原,可引发速发型过敏反应。因此需要控制其含量。 近几十年来国内外对内酰胺抗生素中高分子聚合物的分离分析研究报道有许多,概括起来其分离的方法主要是色谱法,分离模式主要有三类: 凝胶过滤色谱法; 离子交换色谱法; 反相色谱法。,一.凝胶过滤色谱法,凝胶过滤色谱法主要利用分子排
3、阻的原理,即分子量差异进行分离的色谱模式。这对于分离药物中的高分子聚合物是一种简便易行的分离模式。在分离分析高分子聚合物的报道中,此类分离模式也是占主要部分。,凝胶色谱法原理,凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。 它广泛地应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等，而测定蛋白质的分子量也是它的重要应用之一。 凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状颗粒物质。用它来分离物质，主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子（近于球形）具有不同的排阻效应实现的。亦即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。 对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在
4、外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。,色谱柱,在早期的报道中,运用凝胶色谱分离高聚物的色谱柱填料主要采用葡聚糖凝Sephadex G25。但后来报道中指出了Sephadex G25 对一些青霉素类药物(如PL385)有强
5、吸附作用,青霉噻唑酸的峰出现在聚合物峰的区域,氨基(amide) 共价体二聚物与青霉噻唑酸有相同的Kav 值,因此可干扰测定。,Kav即有效分配系数：表示分离化合物在内水和外水体积中的比例关系。 Kav值的大小和凝胶柱床的总体积（Vt）、外水体积（V0）以及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关： Kav = (VeV0)/(VtV0) 在限定的层析条件下，Vt和V0都是恒定值，而Ve是随着分离物分子量的变化而改变。分子量大，Ve值小，Kav值也小。反之，分子量小Ve值大，Kav值大。,后来又有人使用Sephadex LH60 ，虽然对PL385 无吸附作用，但因Sephadex LH60 分离度低
6、,因此也不用于分离聚合物。 总之，以上报道的分离、分析方法因操作繁琐,实验误差大等原因,难于满足质量控制的需要。 因此，近期的报道中主要采用葡聚糖凝胶SephadexG10 填料,其分子排阻量为700 道尔顿(葡聚糖) 。,Sephadex G-10 葡聚糖凝胶分子结构,(1)葡聚糖凝胶 葡聚糖凝胶是指由天然高分子葡聚糖与其它交联剂交联而成的凝胶。葡聚糖凝胶主要由Pharmacia Biotech 生产。常见的有两大类，商品名分别为Sephadex 和Sephacryl。 葡聚糖凝胶中最常见的是Sephadex 系列，它是葡聚糖与3氯1，2环氧丙烷(交联剂)相互交联而成，交联度由环氧氯丙烷的百
7、分比控制。Sephadex 的主要型号是G-10 G-200，后面的数字是凝胶的吸水率(单位是mL / g 干胶)乘以10。如Sephadex G-50，表示吸水率是5mL/g 干胶。Sephadex 的亲水性很好，在水中极易膨胀，不同型号的Sephadex 的吸水率不同，它们的孔穴大小和分离范围也不同。数字越大的，排阻极限越大，分离范围也越大。Sephadex 中排阻极限最大的G-200为8105。,Sephadex 在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液以及有机溶液中都是比较稳定的，可以多次重复使用。Sephadex 稳定工作的pH 一般为210。 但酸溶液和氧化剂会使交联的糖苷键水解断裂，所
8、以要避免Sephadex 与强酸和氧化剂接触。 Sephadex G-25和G-50中分别加入羟丙基基团反应，形成LH 型烷基化葡聚糖凝胶，主要 型号为Sephadex LH-20和LH-60，适用于以有机溶剂为流动相，分离脂溶性物质，例如胆固醇、脂肪酸激素等。,胡昌勤等运用葡聚糖凝胶Sephadex G10 分离分析内酰胺抗生素中的高聚物并进行了一系列的报道，阐述了各种色谱条件对内酰胺抗生素在Sephadex G10 凝胶色谱系统中色谱行为的影响,指出: 溶质的解离主要与流动相中缓冲盐的种类和浓度以及pH值有关,具体如下：,当流动相中离子种类不变,离子强度越大,内 酰胺抗生素的Kav 值越大
9、; 缓冲液中的阴离子种类,阴离子所带的负电荷越多,溶质的Kav 值相对越大,色谱峰越易拖尾; 当流动相中有多元酸/ 盐存在时,pH 通过影响多元酸的解离,改变缓冲液中阴离子类型来改变溶质的保留行为; 流动相的pH 也可通过影响溶质的解离状态来影响溶质的保留行为。对侧链中含有氨基的溶质,流动相的pH 可直接影响氨基的质子化状态。在酸性条件下氨基主要以NH3+ 的形式存在,在碱性条件下氨基主要以NH2 的形式存在,报道中还指出了内酰胺抗生素在Sephadex G10 凝胶色谱系统中，色谱行为的定量关系; 有目的地利用了溶质与 Sephadex G10 凝胶介质间的相互作用在凝胶颗粒内、外有较大差异
10、这一现象,通过选择适当的流动相使内酰胺抗生素和其高聚物达到分离。,同时其利用在特定情况(纯水、0. 5 % 葡萄糖溶液或0. 01mol/ L 甘氨酸溶液为流动相时即药典上所说的流动相B)内酰胺抗生素可以缔合形成表观分子量较大的缔合物,缔合物在Sephadex G10 凝胶色谱系统中色谱行为和高分子杂质一样,Kav = 0 处表现为单一色谱峰这一特点,采用了自身对照外标法对高分子杂质进行精确定量,解决了无高分子杂质对照品和溶质主峰十分宽大(如下图),致使一般积分仪难于准确积分的问题。,图1 高分子聚合物峰形图 Fig 1 The peak of high molecular weight im
11、purities,中国药典从2000 年版起收载头孢哌酮钠、头孢曲松钠、头孢他定、头孢噻肟钠四个品种高分子聚合物的测定,方法均采用Sephadex G10 自身对照外标法；而中国药典2005版在此基础上又增加了头孢拉定、头孢呋辛钠、头孢唑啉钠、头孢噻吩钠、以及青霉素钠和青霉素V钾的高分子聚合物的测定，其方法也同样采用的是自身对照外标法。,自身对照外标法原理： 在Sephadex G10 凝胶色谱系统中，由于Sephadex G10 的排阻分子量仅为700d,因此，除部分寡聚物外， 内酰胺抗生素中 的高分子杂质在色谱过程中均不保留，即所有的高分子杂质表现为单一的色谱 峰，其Kav = 0 。在特
12、定的条件下， 内酰胺抗生素由于分子间的氢键，静电相互作用，疏水相互作用等次级相互作用，可以形成缔合物，导致其表观分子量增大，此时在Sephadex G10 凝胶色谱系统中和高分子杂质具有相似的色谱行为，即在Kav = 0 处表现为单一的色谱峰。,利用此原理，在Sephadex G10 凝胶色谱系统中，以药物自身为对照品，测定其在特定条件下缔合时峰的相应指标，再改变色谱条件，测定样品中高分子杂质和药物分离后在Kav = 0 处的峰相应指标，按外标法计算，即得药品中的高分子杂质相当于药品本身的相对含量。 下面讨论色谱条件与系统适应性试验。,试验条件的选择,一.流动相种类和浓度的选择 流动相的种类与
13、其浓度可以改变溶质的色谱行 为，实验证明，反离子PO 43-明显地改变头孢菌素在SephadexG-10中的色谱行为。 中国药典2005版最常用的流动相A是0.1mol/L的磷酸盐缓冲液（磷酸氢二钠和磷酸二氢钠 61：39），浓度常为0.1、0.01mol/L以及其他浓度，另外也有选用柠檬酸盐、硫酸铵或磷酸盐作为流动相。,流动相B的选择 流动相B常常采用纯水，或者001 十二烷基硫酸钠，05 的葡萄糖溶液也常被作为缔合峰测定的基本洗脱液。 在此条件下， 内酰胺抗生素可以缔合形成表观分子量较大的缔合物,从而表现出与高分子杂质相似的性质，可以作为自身对照溶液的洗脱条件。不过注意温度和时间的影响，需
14、现配现用。实验中发现当对照溶液配制过久，出现的峰形容易拖尾，有可能是缔合峰随时间的增加解离的结果。,二.流动相A pH的选择,流动相的pH 对溶质的保留行为也有影响，通常情况下，pH 和K av间基本呈线性关系。碱性和偏碱性及酸性条件下头孢菌素极易发生聚合反应，其测得的高分子聚合物难以反映样品本身的实际含量。一般采用pH7.0，有的也采用 pH8.0或者 pH6.0。主要通过实验来确定。,三.流速的选择,中国药典2005版测定高分子杂质常用的流速有1.5、1.0、0.8ml/min等， 在做磺苄西林钠实验中，我尝试过1.2 、1.0 以及0.8ml/min不同的流速，结果发现：采用1.0ml/
15、min对磺苄西林钠主峰和高分子杂质的分离最好，所以采用1.0ml/min作为测定的流速。,四.温度的影响,样品中高聚物的含量较低, 高分子杂质对温度比较敏感。实验中我们也发现柱温箱设置不同温度时,对杂质含量和峰形均有一定影响。为保证检测的准确度和重复性,实验中应注意控制温度,且样品处理后必须立即进样,避免其他因素干扰杂质测定的真性。,系统适应性实验,用蓝色葡聚糖2000做系统适用性试验，其保留时间与柱效及拖尾因子等参数共同代表着色谱柱的性能。在2005年版药典二部各品种高分子聚合 物测定方法项下的系统适用性实验中，规定在两种流动相系中蓝色葡聚糖2000的保留时间(tRA， tRB)比值应在093107之间；对照品测定的 保留时间(t )，供试品溶液中高分子聚合物的保 留时间(t ”)与相应色谱系统中蓝色葡聚糖2000 的保留时间(tRA，tRB)比值应为093107 。,另外，分别以流动相A、B为流动相，取0.1mg/ml的蓝色葡聚糖2000峰计算均不低于700，拖尾因子均应小于2.0。另外，以流动相B为流动相，精密量取对照溶液200l,连续进样5次，峰面积的相对标准偏差应不大于5.0。,方法学考察及样品的测定,Thank you !,
