矿物微生物浸出资源加工学

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1、12.1 微生物浸矿,12 矿物微生物浸出,12.1.1 浸矿微生物种类、来源及生理生态特性 1)种类 自养菌 在生长和繁殖过程中，不需要任何有机营养，而是完全靠各种无机盐而生存的这类微生物。 异养菌 需要提供现成有机营养才能生存的一类微生物。,结论: 与矿物浸出有关的微生物大部分属于自养菌，某些异养菌也可以溶浸金属矿物，在生产中得到实际应用的主要是自养类微生物。,常见的浸矿自养菌 排硫杆菌 特征： 菌体呈杆状，在液体硫代硫酸盐培养基上可以生成小而圆的菌落，由于生成硫沉淀，菌落呈黄色。 通常只存活一个星期左右，它可将硫代硫酸盐氧化成元素硫，又将元素硫氧化成硫酸。,氧化硫硫杆菌 特征： 为圆头短

2、杆状，通常以单个或成双、成短链状存在，在菌体两端各有一油滴，可将培养基中的硫溶入油滴之中再吸入体内进行氧化 其氧化元素硫的能力比氧化硫化合物的能力强，可以产生较多的酸，并有较强的耐酸性能，可耐5%的硫酸。,蚀阴沟硫杆菌 特征： 与氧化硫硫杆菌类似，但它可以利用硝酸盐和铵离子作为氮源，不能利用亚硝酸盐。,氧化铁铁杆菌 特征： 呈短杆状，可将亚铁离子氧化成高铁离子，在液体培养基中由于生成Fe3+使培养基由浅绿色变成红棕色，在固体培养基上长成红棕色菌落。,氧化铁硫杆菌 特征： 菌体呈杆状，它可以氧化亚铁为高价铁，也可将硫代硫酸盐氧化为硫酸。 含亚铁的液体培养基中，亚铁被氧化使培养基变成红棕色，Fe3

3、+水解成氢氧化物或铁矾沉淀。 用不含铁的液体培养基，则由于硫代硫酸盐氧化生成硫酸，使培养基酸度提高。,自养化能菌的特征 靠氧化培养基中的亚铁离子或硫化合物取得能量以空气中的CO2作为碳源，并吸收培养基中的氮、磷等无机盐营养，合成菌体细胞。 菌的生活需要氧气，属于好氧菌，它们广泛生活于金属硫化矿和煤矿等矿山的酸性矿坑水中。 除利用的能源有差异外，其他性质都十分相近。,说明： 氧化硫硫杆菌、氧化铁铁杆菌和氧化铁硫杆菌三种自养菌的性能十分相近，而且难以将它们分开，所以有人视它们为一种菌，定名为氧化铁硫杆菌。,12.1.2 浸矿细菌的培养基 液体培养基 由水和溶在水中的各种无机盐组成的，液体培养基用于

4、粗略地分离培养某种微生物。,异养菌 平板分离用的固体培养基，是在液体培养基中加入1.5%琼脂（洋菜）或一定量硅胶制成的。 方法：在加热条件下配成一定浓度的消毒琼脂溶液后，再加入无菌过滤的FeSO4等无机盐母液，用H2SO4调节好酸度，冷却至常温即制成固体培养基。 进行微生物的纯种分离则要用固体培养基。,12.1.3 细菌的采集、分离与培养 1) 采集 地点 浸矿细菌可分布于土壤、水体及空气中，但较为集中的地方是金属硫化矿及煤矿的酸性矿坑水。所以采集这类菌的最佳取样点是煤矿、铜矿、铀矿等有酸性矿坑水的地方。如，矿坑水的pH值为1.53.5并呈棕色（说明有Fe3+存在），则很可能存在氧化铁硫杆菌。

5、,方法 取50250mL细口瓶、洗净并配好胶塞，用牛皮纸包扎好瓶口，置于120烘箱灭菌20min，冷却后可作为细菌取样瓶，带取样瓶到上述矿山取酸性坑水。,2)培养 步骤 配好的培养基用蒸汽灭菌15min后，在无菌操作下分装于数个已洗净并灭菌的100mL三角瓶中。 每瓶装培养基20mL，用洗净干燥吸液管分别取15mL矿水样加到三角瓶中，塞好棉塞置于2035恒温下，静置培养（或振动培养）710天。,细菌生长繁殖使三角瓶中培养基的颜色由浅绿变为红棕色，最后在瓶底出现高铁沉淀。 选择变化最快，颜色最深的三角瓶，在瓶中取1mL培养液，接种到装有新培养基的三角瓶中，同样培养。培养液将比头一次更快的变红棕色

6、。,按同样办法反复转移培养10次以上。每转移一次只需12滴，接种量逐渐减少而所培养的细菌却越来越活跃，只需培养35天就可把培养基中的Fe2+氧化为Fe3+。,培养的机制 在转移培养中，借助培养基的高酸度，可杀死淘汰掉一些不嗜酸的杂菌，同时由于培养基中的高浓度亚铁离子，只有氧化亚铁的细菌才能生长繁殖，其他菌则被杀死淘汰掉，而氧化铁硫杆菌则得到充分繁殖，活性越来越大。,氧化铁硫杆菌的检查和鉴定方法 肉眼观察 如有该菌生长，则培养基中的亚铁将被氧化变成高铁，培养基的颜色由浅绿变成红棕色，最后产生高铁沉淀。 重铬酸钾容量法测定 测定培养液中亚铁变成高铁的数量。变化快的，说明细菌生长旺盛。 显微镜观察

7、观察细菌的形成，是否具有氧化铁硫杆菌的形状特征。 说明： 上述方法得到的菌种是不纯的，如要分离纯种，上述分离过程要无菌操作，并且要作平板分离。,平板分离 方法 把配制好的固体培养基倒入培养皿制成平板。 在无菌操作下，用接种环取上述培养菌液在平板上划线分离，使所取菌液中的菌体细胞尽量沿划线分散开。 将划好的线培养皿在2530条件下恒温培养。,经10天左右，借解剖镜挑选适当菌落并用取样针转移到装有数毫升培养基的小试管中恒温培养，一般7天左右培养液就可变成红棕色。 将此培养液重新在固体培养基上划线分离，如此反复进行数次分离和培养，就可获得纯菌株。,12.1.4 细菌生长曲线 分成四个时期 生长缓慢期

8、 对数生长期 稳定生长期 衰亡期 说明： 以上是所有微生物生长繁殖所必须经历的四个时期，每个时期的长短和细菌的活跃程度受环境因素制约。,生长缓慢期 当细菌由一个环境转移到一个新环境时，会出现一个逐步适应的缓慢生长期，细菌生长繁殖速度很慢，细菌也不活跃。根据被培养细菌对环境的适应性，这个时期可能很短，也可能较长。 比较正常的情况是24周 如果在含硫化铜培养基中培养，一般要24周 如果细菌的养料不变，则转移当中的的缓慢期就很短，甚至没有缓慢期。,对数生长期 随着细菌适应环境后，生长非常活跃，以对数增长的速度繁殖，此时细胞数目大量增加，对数生长期的曲线斜率就是细菌生长率： 这个时期新增加的细菌数目远

9、超过死亡的细菌数。,稳定生长期 细菌死亡数目和新生数目大致相等，总的细菌数维持恒定。这个时期培养器内细菌的绝对数是最多的。但此时培养基中营养大量消耗，细菌已变得不太活跃，当进入大量培养或用于生产接种时，应当使用稳定期内尽量靠近对数期的细菌。 衰亡期 细菌开始大量死亡，培养器内总的细菌数目急剧减少。此时培养基中的营养物质已基本消耗完。,12.1.5 浸矿细菌的驯化 1)影响细菌生长的因素 浸矿细菌的细胞膜类似于半透膜，可透过水分而对其他物质有选择性。细菌较其他生物细胞对渗透压的变化有较强的适应能力，但外界盐分浓度过高，会抑制细菌生长，甚至因渗透压变化过大，造成细菌死亡。,重金属离子可使细胞蛋白质

10、凝固，大部分重金属离子对细菌有毒性作用，超过一定限度，细菌会因细胞脱水而死亡。 非金属离子对细菌影响小些，但浓度过高也不行。如F-，细菌对它很敏感，浓度超过几个ppm就会严重抑制细菌生长。,2)细菌的驯化 驯化机制 对细菌进行转移培养过程中逐渐变化外界条件，使对新环境不适应的细菌死亡，而某些活力较强的细菌会发生变异，演变成耐受性更强的细菌而活下来，形成新在耐性菌株。,驯化方法 在装有一定体积培养基的三角瓶中加入较低浓度的金属离子后，接种入要驯化的细菌进行恒温培养，待细菌适应能正常生长后，将它再转移到含有更高浓度金属离子的培养基中继续培养。依此类推，每转移一次都提高金属离子浓度，最终可获得对该金

11、属离子具有较强耐性的菌株。,12.1.6 细菌的计量 比浊法 利用菌液所含细菌浓度不同，液体混合度不同，用分光光度计测定菌液的光密度的办法进行计算。将光密度大小与标准曲线对比，可以推知菌液的浓度。,直接计数法 利用血球计数器，取菌液样品直接在显微镜下观察计数。若测定单位菌液体积所含活菌数目，则须用平皿计数法和稀释计数法。,平皿计数法 将稀释后的菌液用固体培养基制成平板，然后在一定温度下培养，使其长成菌落，计算菌落数目，再乘以稀释倍数，则为所测菌液的活菌浓度。,稀释法 将菌液按10的倍数在培养基中连续稀释成不同浓度，然后进行培养。观察细菌能够生长的最高稀释度，此最高稀释度培养液中的细菌数目为1个

12、，则可按总的稀释倍数计算出原菌液内所含活菌的浓度，一般达到正常繁殖情况下菌液活菌浓度为1061010个/mL。,12.2 微生物浸出基本原理,12.2.1 直接作用说 1)论点 在有水和空气的条件下，受氧化铁硫杆菌作用，金属硫化矿会发生如下反应： 2FeS2+7O2+2H2O2FeSO4+2H2SO4 4FeSO4+O2+2H2SO4 2Fe2(SO4)3+2H2O CuS+2O2 CuSO4 CuFeS2+4O2 CuSO4+FeSO4,2) 细菌直接作用的证据 在无Fe3+条件下细菌可以浸蚀辉铜矿和铜蓝。 细菌可浸蚀元素硫。反应是： 2S+3O2+2H2O 2H2SO4 (无菌下此反应难发

13、生),对比细菌和Fe3+浸出辉铜矿（CuS2）发现二者的反应产物不同。 Fe3+为元素硫： Cu2S+2Fe2(SO4)3=2CuSO4+4FeSO4+S 细菌不产生元素硫： Cu2S+H2SO4+2O2 = 2CuSO4+H2O,用细菌浸出已知组成的铜蓝和辉铜矿发现有菌与无菌条件下铜蓝的浸出速度相差很大。,由于浸出环境中没有Fe3+及其他氧化剂，所以浸出作用只能是由细菌引起的，在浸出期间酸耗等于零。矿物中CuS与S被等速浸出，反应如下： Cu+1/2O2+2H2+=Cu2+H2O S+3/2O2+H2O=2H+SO42+ 总反应 ：CuS+2O2=CuSO4,用磨光的人造铜蓝进行浸出试验，用

14、显微镜观测和电子探针分析表明，细菌浸出在整个矿物表面发生，浸出后矿物表面的化学组成未发生变化。说明浸出中没有转化为其他硫化物的中间过程，也没有产生元素硫。CuS浸出的电化学反应如下： CuS=Cu2+S+2e 阳极反应 2H+ +O2+2e=H2O 阴极反应,12.2.2 间接作用说 1)论点 自然条件下黄铁矿缓慢氧化生成FeSO4和H2SO4，在有细菌的条件下，反应被催化快速进行，最终生成Fe2(SO4)3和H2SO4。,Fe2(SO4)3是一种很有效的金属矿物氧化剂和浸出剂，铜及其他多种金属矿物都可被Fe2(SO4)3浸出： 黄铁矿：FeS2+7Fe2(SO4)3+8H2O=15FeSO4

15、+8H2SO4 辉铜矿：Cu2S+2Fe2(SO4)3=2CuSO4+4FeSO4+S 氧化铜：Cu2O+Fe2(SO4)3+H2SO4=2CUSO4+4FeSO4+H2O 铀 矿： UO2+Fe(SO4)3=UO2SO4+2FeSO4,2)细菌间接作用的证据 黄铁矿的细菌浸出有直接作用也有间接作用。 2FeS2+7O2+2H2O=2FeSO4+2H2SO4 FeS2+7Fe2(SO4)3+8H2O=15FeSO4+8H2SO4 有铁时的浸出速度比无铁时快，说明黄铁矿细菌浸出，高铁氧化作用比细菌直接氧化作用更重要。加入Fe2+和加入Fe3+的浸出效果不一样，说明细菌氧化Fe2+的速度远远高于F

16、e3+被黄铁矿还原的速度。 结论： 黄铁矿细菌浸出以Fe3+间接氧化作用为主。,12.2.3 复合作用说 1)论点 复合作用机制是指在细菌浸出当中，既有细菌的直接作用，又有通过Fe3+氧化的间接作用。有些情况下以直接作用为主，有时则以间接作用为主，但两种作用都不可排除。 这是迄今为止绝大多数研究者都赞同的细菌浸出机制。,2)复合作用的证据 黄铁矿的浸出 辉铜矿的浸出反应： Cu2S+H2SO4+O2=2CuSO4+H2O 直接作用：不生成S Cu2S+H2SO4+5/2O2 = 2CuSO4+H2O 间接作用：生成S，但S又被氧化为硫酸 Cu2S+2Fe2(SO4)3=2CuSO4+4FeSO4+S 单独用Fe2(SO4)3浸出：可看到沉淀S生成,12.2.4 电位-pH图 硫细菌和铁细菌的生活环境，正处于金属硫化矿及Fe2