狂犬病的试验室检测与诊断技术

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1、狂犬病的 实验室检测与诊断技术,中国生物技术集团公司 武汉生物制品研究所 基因工程室 严家新 徐葛林,1. 临床诊断与实验室诊断,实验室手段对狂犬病的确诊非常必要。 要求狂犬病病例的统计上报资料要注明诊断的依据（是否包括实验室诊断？）。目前国际上公认狂犬病的死亡率是100%，原则上不承认有狂犬病康复的可能，即狂犬病的发病率应与死亡率相等。没有合格实验室给出的肯定诊断的康复病例应从狂犬病病例的统计数字中剔除。 “狂犬病患者必死无疑，不死不算狂犬病” ，要挑战这个命题，必须提供确切、完整的病史和权威的实验室诊断资料。,2. 人狂犬病的生存期内诊断,生存期内的诊断技术的选择主要随着病程的不同而异。

2、在病后最初几天，检测抗原一般是敏感的。 脑脊液及血清中的病毒中和抗体常常趋向于在病后710天出现。 检测抗原可用荧光抗体（FA）法检查狂犬病患者角膜印片或皮肤活组织，但是，FA阳性标本在发病的后期更常见。皮肤活组织检查常常从颈背部取含有末稍神经的带有毛囊的标本。 角膜印片(切勿划痕)取自伴有脑炎的患者，用显微镜的载波片轻轻触及角膜的中心部位。 角膜印片及皮肤活组织标本的质量很重要，采取后应立即冷冻，直至检测。不过，用FA技术做生存期内的诊断，其敏感性是有限的。,人狂犬病的生存期内诊断,已证实患者及自然感染和实验感染动物的角膜印片中存在狂犬病抗原。但是，角膜印片检出率较低，阳性结果可肯定是狂犬病

3、，而阴性结果并不能排除是狂犬病的可能。 虽然在临床症状开始时，在皮肤活组织中可能检出狂犬病抗原，但早期症状时仅有25-50%的患者为阳性，随着病情的进展阳性率也增加。颈背部皮肤活组织检查只有一些患者呈阳性结果，特别是在临床疾病的早期。 用FA检查皮肤活组织的灵敏度一般高于检查角膜印片。,3. 动物和人狂犬病的死后诊断,抗原检测 病毒分离 病毒鉴定等。 为了确保实验室结果的可信性，必需满足若干条件： 1. 标本质量要好； 2. 标本送达实验室的条件要好（符合GLP标准， 获得一定级别的资格认证）； 3. 获得结果的等待时间要短； 4. 结果的传递要迅速。,二 狂犬病诊断实验室的安全措施,1. 危

4、险性 在一般的实验室条件，技术人员暴露于以下传染的危险： 野生狂犬病毒(即街毒)，当实验室对接收到的动物标本进行尸体解剖时或对标本进行加工时(悬液制备，离心)等，这一类操作是非常危险的，必须在P3以上条件的专业实验室中进行。 实验室适应的病毒(即固定毒)，当接种实验动物或操作感染的细胞培养时，特别是制备大量的高浓度病毒时，主要的传染来源为手指被有感染的玻璃或工具刺伤或割破；新糜烂的皮肤或粘膜与感染物接触也应认为是一种传染的危险。虽然固定毒的毒力已大为下降，历史上仅有一例死于固定毒操作的报道，但仍有一定的危险性，因此操作固定毒仍须十分小心。,生物安全级别对工作人员的要求 (Biological

5、Safety Level, BSL ) (Protection, P ) BSL-1：实验人员在实验程序方面受过特殊训练，由受过微生物学或相关科学一般训练的科学工作者监督实验。 BSL-2：实验人员均接受过病源处理方面的特殊培训，并由有资格的科学工作者指导。 BSL-3：实验人员应在处理致病性的和可能使人致死的病源方面受过专业训练，并由对该病源工作有经验的、有资格的科学工作者监督。 BSL-4：实验室成员应在处理特别危险的传染源方面受过特殊和全面的训练，应了解标准和特殊操作中一级和二级遏制的作用、遏制设备、实验室设计性能。实验由在有关病源方面受过训练、并有工作经验的、有资格的科学工作者监督。,

6、2. 对安全操作的建议,操作所有潜在狂犬病感染的材料均应在 P2或P3生物安全实验室内进行。 对狂犬病实验室诊断的安全性要求： 一个封闭的环境，专作狂犬病感染性工作 通过缓冲更衣间并限制一定的专业人员进入； 穿专用的实验室隔离无菌衣和鞋； 操作完毕对操作台进行消毒(当材料偶然地溢出时应立即用3的雷苏尔溶液或其他相应的消毒剂消毒)； 每日应至少消毒地板一次； 所有用后剩余的标本，尸解工具，实验室材料在拿出实验室前应进行高压蒸气消毒。 在生物安全柜或隔离器内打开动物颅盖骨的操作很困难，技术人员在操作这项工作时应带面罩，护目镜、手套和围裙。 由于与狂犬病相关病毒对人的致病性还不很了解，所有操作可能含

7、有这些病毒的标本均应在生物安全柜内进行。 所有实验室工作人员务必进行狂犬病疫苗的暴露前免疫，这些人员的中和抗体应定期检查，所有意外地暴露于感染时必需立即报告负责人。,三 狂犬病毒抗原的检测,1. 标本选择 在选择、运送标本前，实际操作获得标本的人员与实验室检测人员事先取得联系共同选择实验方法是很重要的。,1) 标本取自个体的生命期,检查病毒和(或)抗原：样品应放在干燥试管内。样品的获取可按下述方法进行。 (1)用注射器或吸管吸入法采集唾液(不用棉拭)，CSF，皮肤活检等样品。 (2)角膜涂片，用显微镜载玻片直接接触角膜操作(不要用棉拭)，标记玻片，空气干燥并用铝锡纸单片包裹。 。检测抗体：血液

8、、CSF或血清采集于干燥试管内，并低温冰冻存放。,2) 标本取自死亡后的个体,送至实验室标本的方式依动物种类不同而不同。 (1) 小的野生动物(包括蝙蝠) 送完整的个体以便对动物品种进行准确鉴定。 (2) 家养食肉动物(狗、猫)或野生食肉动物 (狐狸、貉、浣熊、臭鼬、豺等) 仅送头部。 (3) 更大的动物(家养或野生食草动物) 打开头盖骨并取脑送至实验室。,标本取自死亡后的个体（人）,对人狂犬病在有可能进行全面尸解时，把整个脑取出，或选择一些部位切下(海马角、脑干、皮质、小脑)送至实验室。 在特殊情况下(困难的野外条件，动物流行病学检测)以及因宗教或传统原因对狂犬病人无法尸解时，可以用塑料管或

9、吸管穿进枕骨孔或眼窝后取出一些脑组织)。,2. 标本的运送,标本运送必需严格遵循安全要求，包装务必要有保证。 1) 可靠的诊断要有一个保存良好的标本； 2) 运送狂犬病标本的服务人员应事先进行过抗狂犬病免疫并证明已得到完全的保护。 3) 小动物的躯体或较大动物切下的头部标本可用10甲醛溶液处理过的材料包裹，然后放入一个厚塑料袋内扎紧。 如仅取脑(大动物)则应把脑放人一个坚固的塑料或金属容器内并密封，标本作好标记，外加第二层包装并放人泡沫塑料盒中。远距离运送时可用干冰保冷。 泡沫塑料盒用牢固的粘性带仔细封固；把全部有关标本的资料放在信封内固定在盒上，再装进一个纸板箱内。箱上应清楚地标明“小心，有

10、感染性生物材料，狂犬病诊断用生物学标本”字样。 当无冷冻条件且标本较小时，可以将小块脑组织放进装有80甘油缓冲液的小瓶内，以保存其感染性。 在无需保存标本的感染性，准备用免疫荧光法检测抗原时，则可将脑组织标本用10甲醛固定(固定液内应含有苦味酸)。,3. 标本的获取,1) 动物脑组织的获取 1) 将动物头部放在解剖台上用骨固定钳于上颁骨处牢牢固定住，用锋利的屠刀从眼部至颅骨底部作一中线切割。 然后将颞肌从颅部切除，颅盖骨用割刀和锤子等工具割掉。 对大动物可用一外科骨锯在眼部二侧上方将头盖骨横切，切除脑膜，将髓质和脑神经切割后，即可将脑取出放在一纸盘或大平皿内。,动物脑组织的获取,2) 特异性病

11、毒包涵体在脑的一些部位更丰富，特别是海马回，为了暴露海马回，从一脑半球背面约半球间沟外侧2cm处往下通过灰质和白质直到侧脑室作一纵切。海马角像一半园柱形闪光体从脑室底部凸出，小脑和脑干也富有病毒包涵体。当标本保存不好时，通常脑干，髓质和视神经还能保持完好。 在常规的操作中，采集海马角、一小块脑干和一小块皮质放在平皿内，在底部和上面标上标本的序号。平皿立即放置于通风柜内处理或保存在4冷柜内。,2) 唾液腺的获取,为取出颌下腺，在复盖于下颌骨间的皮肤上作一切割，将皮肤往外侧翻，两侧的颌下腺位于颌骨后部边缘表面。在下颌下淋巴结的后面（这二种不要相混淆）。,4. 标本的快速收集技术,在某些情况下可能难

12、于或不可能尸解以便打开颅骨取脑, 为减少这些困难已经设计出简便的技术，即用塑料管插入颅骨采集一小块脑组织体。 第一种技术是用吸管通过枕骨孔插入并往前推至一眼睛部位，则吸管中的脑组织内含有部分脑干，小脑，海马回和皮质。 第二种技术为将吸管通过眼窝后壁(用套管穿孔)并推至枕部，脑组织内含有部分皮质、海马回、小脑。,1) 材料,取样试管、塑料或玻璃吸管、套管。 保存或运送溶液：80甘油 PBS。,2) 方法,(1) 枕部途径： 把动物颈部往前弯曲，切开枕部和第一颈椎间的皮肤和肌肉； 割开寰椎一枕部韧带，打开关节； 将取样管通过枕孔插入并推向一只眼，拔出吸管，里面含有脑组织柱状体。 (2) 后眼框途径

13、： 将眼球推向一边，用套管在眼窝后壁穿孔； 将取样管插人推向颅骨后部对侧拔出，吸管内即含有脑组织柱状体。 (3) 脑柱体的收集： 用合适的棉拭子或用橡皮球从管于的清净端吹气将脑柱体从管子内推在平皿内； 如试验诊断需延期进行则将脑柱体放进装有甘油溶液的螺旋盖小瓶中。,5. 荧光抗体实验 Fluorescent Antibody Test (FAT),该方法的特点是： 耗时短，整个FAT操作需30分钟，若加上涂片、固定，则需2-4小时。 与小鼠颅内接种试验MIT相比，符合率达99% 。 需荧光显微镜及高质量的荧光标记抗体。,狂犬病毒抗原,荧光标记抗 狂犬病毒抗体,免疫荧光实验检测狂犬病毒抗原,荧光

14、抗体实验检测狂犬病毒抗原,FAT的技术要求： 由于狂犬病毒多分布在动物脑海马回及脑干处，因此合适的取样部位对抗原的检测很重要。 脑样品印片必须用丙酮固定5-10分钟，因为丙酮可去除细胞膜表面的脂类，以便抗体到达细胞内与狂犬病毒结合。 脑样品必须保存在含50%甘油的生理盐水中，印片染色前需用生理盐水洗涤数次。 荧光标记抗体需最大限度降低非特异性反应，因此制备特异性、高效价的抗体是FAT的关键。,荧光抗体实验检测狂犬病毒抗原,操作要求： 印片不能太厚，否则易出现假阳性 一个切面最多可印4次，否则易出现假阴性 丙酮固定时间不宜太长 洗涤不宜过度 判读结果应快速，以免荧光淬灭,用抗狂犬病毒核蛋白的 单

15、克隆抗体制备荧光结合物,我室目前采用抗狂犬病毒核蛋白的单克隆抗体制备荧光结合物，经法国巴斯德研究所多次实验，分别检测了人、犬、猫、狐狸、臭鼬、蝙蝠等动物来源的样品，证实我们的荧光抗体具有非特异性小、灵敏度高的特点，质量上不比法国的产品差。 我们用该方法检测了我国广西狗肉市场上出售的食用狗的脑组织，结果发现在154份外观健康的犬中，有5份为狂犬病毒抗原阳性，并且通过乳鼠颅内接种，我们已分离到这5株狂犬病街毒株。,6. 快速狂犬病酶免疫诊断法 Rapid Rabies Enzyme Immunodetection (RREID,抗狂犬病毒单抗,狂犬病毒样品,酶标抗狂犬病毒抗体,6. 快速狂犬病酶免

16、疫诊断法,技术特点： 本试剂盒操作方便、快速灵敏，适于大量样本的检测。 本试剂盒中酶标板包被后需立即使用或保存于-20C备用。 肉眼观察：阳性对照显黄颜色，阴性对照完全无色。所有显黄色样品，无论深浅均认为是阳性。这种肉眼观察已足够作出诊断，非常经济，因为不需要昂贵的酶标仪，也最适合于作现场流行病学调查。 酶标仪读数：仔细擦净平板底面，用450nm滤光片读数。阳性对照光密度值（OD）必须大于1.0单位，阴性对照OD值须低于0.1单位，判定值（CUT OFF）的确定：阴性对照OD值 0.008。OD值等于或大于CUT OFF的标本均视为阳性。 福尔马林固定的样品不适宜作RREID。,7. 各种抗原检测方法的比较：,直接荧光抗体试验（FAT）: 最大优点是快速、费用低且敏感性和特异性高。 快速狂犬病酶免疫诊断（RREID）试验: 也是一种快速的诊断方法，有非常好的敏感性和特异性；与 FAT一