分子生物学试验技术

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1、分子生物学实验技术,武汉大学基础医学院生化与分子生物学系 喻红 Tel : 68759795(O),基础医学研究技术_,分子生物学研究,分子生物学研究对象 分子生物学研究技术 实验内容： 核酸的分离纯化、鉴定与分析 基因工程技术基本流程,Contents,核酸的分离制备及分析,1,基因工程基本流程,2,分子生物学实验常用仪器介绍,3,2011级硕士生分子生物学实验,核酸的分离制备及分析及在医学研究中的应用 DNA的制备与分析 真核细胞基因组DNA的分离纯化(蛋白酶K法) DNA的紫外定性、定量分析及琼脂糖凝胶电泳鉴定 基因表达水平分析的原理与方法（RNA的分离纯化及分析） 真核组织总RNA提取

2、（TRIzol试剂法） RNA紫外定性、定量分析及甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定 目的基因PCR及PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定 凝胶成像系统的应用（示教） 基因工程技术基本实验 利用感受态细菌（DH5a）进行重组质粒转化、Amp琼脂平板筛选 利用阳性克隆菌（单菌落）进行质粒的小量扩增 质粒DNA提取（碱裂解法） 质粒DNA的限制性内切酶酶切及酶切片段非变性 PAGE鉴定,2011级硕士研究生分子生物学实验课程表,核酸的分离与纯化,基本原则： 1、保证一级结构的完整性，完整的一级结构是研 究核酸结构和功能的基础； 2、排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染。,真核核酸提取的主要步骤,来源：真核生物的

3、一切有核细胞（包括培养细胞） 温和裂解细胞，溶解核酸，使核酸与组蛋白分离； 采用化学或酶学方法去除蛋白质、DNA/RNA及其他大分子。,Step 1,Step 2,Step 3,Step 4,细胞的破碎： 物理方法 溶胀和自溶 化学方法 生物酶降解,核酸的纯化,核酸的浓缩和沉淀,核酸的贮存,核酸分离提取的主要步骤,真核基因组DNA的制备与分析,蛋白酶K苯酚抽提法分离纯化真核细胞基因组DNA DNA的紫外定性、定量分析及琼脂糖凝胶电泳鉴定,制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤。可从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取。常采用EDTA、SDS以及蛋白酶K等试剂作用下破膜、消化

4、细胞，并使组织蛋白与DNA分子分离，再用酚、氯仿/异戊醇抽提去除蛋白质，最后经乙醇沉淀而获得高纯DNA。操作中常加入RNase除去RNA，这一方法获得的DNA可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、基因组DNA文库构建等实验。通常可得到100200kb的DNA片段。（一般真核细胞基因组DNA有107-9bp。） DNA提取应注意 （1）防止和抑制DNase对DNA的降解； （2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。,蛋白酶K苯酚抽提法,操作步骤,1材料处理 新鲜或冰冻组织处理： 取约50100mg肝组织, 剪碎，加组织细胞裂解液0.5ml匀浆。 将匀浆液转至1.5ml Eppend

5、orf管（Ep管）中。(此时于匀 浆液中加入终浓度为20g/ml的无DNase的RNase A)。 加5l蛋白酶K (终浓度100g/ml)，混匀。 37水浴1h后转为50水浴3h（裂解细胞，消化蛋白）， 经常摇动。,2室温下加500l饱和酚至样品处理液中，缓慢颠倒混匀10min。 3离心12000rpm10min,取上层水相到新Ep管中 (约450l)。 4加等体积氯仿/异戊醇（24：1），充分混匀，离心12000rpm10min，取上层水相(约300l)到另一Ep管中。 5加1/10体积的3 mol/L 醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积预冷的无水乙醇，颠倒混匀。 6离心14000rpm1

6、5min，小心弃上清液。 7沉淀用70%冷乙醇洗涤1-2次，离心收集沉淀DNA,室温下挥发乙醇(勿使DNA完全干燥)。 8沉淀DNA加50-100l TE缓冲液溶解，20保存或直接分析.,操作步骤,标本必须新鲜，提取前细胞应保持完整。所用Ep管、滴头等用品及ddH2O、试剂等应高压灭菌，操作尽量在4以下进行。 混匀试剂、吸取上清液等操作时应避免动作剧烈。 弃去乙醇时动作应轻，切忌甩干，以免DNA丢失。 37%以上浓度的异丙醇或者70%以上浓度的乙醇可选择性沉淀DNA，一般不需在低温条件下长时间放置。其缺点是易使盐类与DNA共沉淀；所以常规需要70%乙醇漂洗DNA沉淀物。 室温下放置16h或65

7、放置1h，可加快基因组DNA沉淀的溶解。,注意事项,核酸的鉴定与分析,紫外分光光度法可用于确定核酸的浓度及纯度。 核酸的分级分离。层析技术及凝胶电泳法，凝胶电泳分离法分制备型和分析型，根据分离核酸片段的大小可选择不同参数或条件的琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳。 核酸杂交技术用于鉴别某个特定的片段。 多聚酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）对目的基因进行DNA序列分析及鉴定 。 DNA测序 基因表达分析:（RNA详细结构和数量的分析）,DNA的鉴定,一、紫外法测DNA的纯度及浓度 原理 组成核酸的嘌呤嘧啶碱基均有紫外吸收特性，最大吸收峰在260nm，这是紫外测

8、定核酸的基础。蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。OD值为1时相当于大约50g/ml双链DNA 。通过测定A260和A280的比值可估算核酸的纯度。紫外法仅用于测定浓度大于0.25g/ml的核酸溶液。,操 作,取15lDNA样品溶于双蒸水至3ml，分别于260、280、230nm 处比色并记录。 定量分析： DNAA260核酸稀释倍数50/1000 纯度分析： DNA A260/A280=1.8 A260/A2801.8，有RNA杂质，用RNase消化； A260/A2801.7,有杂蛋白，重复抽提纯化步骤; A260/A2302.0，可能有盐未除尽。 注：此法

9、不能区分DNA和RNA，不能用于核酸粗制品的测定。,核酸凝胶电泳核酸的分级分离,核酸是带均匀负电荷的分子，在电场中向正极移动，不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同。以适当浓度的凝胶介质作为电泳支持介质，具有分子筛效应，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离的目的，此为分离、鉴定和纯化核酸片段的标准方法。,影响核酸电泳的因素,1 核酸的性质 核酸的电荷量，分子大小，分子的空间构象等 2 凝胶孔径的大小 琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel, PAG)是核酸凝胶电泳常使用的支持材料，表7-1列出不同凝胶浓度与其对应DNA分子的分离范围。 3 电场

10、强度和电场方向 低电压时，线状DNA片段的电泳迁移率与电压成正比。 4 电泳环境 缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。常用有三种，即Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE).TBE 的DNA分离效果好，TAE缓冲容量低，但便宜。缓冲液中的EDTA可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性.,核酸电泳的指示剂与染色剂,核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青 溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，在1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的dsDNA片段大致相同. 二甲苯青的水溶液呈兰色，它在 1%和1.4%琼脂糖中电

11、泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似. 指示剂一般与甘油、蔗糖或聚蔗糖400组成上样缓冲液.上样缓冲液的作用有增加样品密度(比重)，使DNA沉入加样孔内.在电泳中形成肉眼可见的指示带，可推测核酸电泳的速度和位置.使样品溶液呈色，使加样操作更直观方便。 核酸电泳后需染色后才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色法，其次是银染色. 溴化乙锭(ethidium bromide，EB)是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光。银染色：银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，可将核酸带染成黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色.,琼脂

12、糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法.琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物.根据琼脂糖的溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖.低熔点琼脂糖熔点为6265，溶解后在 37下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等.,二、DNA的琼脂糖凝胶电泳,原理 DNA分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分子筛效应向正极移动过程中, 因DNA分子的大小及构象差别而呈现迁移位置上的差异，对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。电泳时加溴化乙锭（EB），其与DNA结合形成一种荧光络合物，在254365

13、 nm紫外线照射下可产生桔红色的荧光，可用于检测DNA。,DNA的鉴定分析,【操作步骤】,1琼脂糖凝胶板的制备：将1%2%琼脂糖凝胶加热溶化均匀，冷却到6070，倒入凝胶槽，厚度约35 mm，放置样品梳，待冷却成形后取出梳子及隔板，放入水平电泳槽中，缓冲液淹没过胶12 mm为止。 2加样：样品中加1/5体积的6凝胶上样缓冲液混匀，取15 l加入凝胶点样孔中。同时要设立合适的DNA分子量标准物。 3电泳：电压210 V/cm 胶, 待溴酚蓝移至凝胶的2/3距离时，关闭电源。 4取出凝胶，浸于0.5 g/ml EB溶液中染色2030min后, 置紫外透射反射分析仪上观察，即可见桔红色的DNA区带。

14、,【注意事项】,1加样时勿破坏样品孔，否则DNA带型不整齐。 2上样缓冲液中适量的甘油，蔗糖或聚蔗糖400可增加样品密度，使样品均匀沉到样孔底，而溴酚蓝、二甲苯青可使样品带色，便于上样及估计电泳时间和判断电泳位置。 3EB是一种强烈诱变剂并有中度毒性，应戴手套操作，对于含有EB的溶液用后应妥善净化处理。 4EB也可预加在凝胶中或上样缓冲液中进行DNA电泳时的同步染色，但EB是带正电荷的分子，电泳时向阴极移动，会影响DNA的实际迁移率。若延长DNA电泳时间，EB会从凝胶中迁移出来，从而使小片段DNA难于检测，可将凝胶浸在0.5 g/ml EB溶液中重新染色后检测。 5加样孔的加样量依DNA样品中

15、片段的数量及大小而定，通常对0.5cm宽的加样孔，DNA上样量在0.10.5g即可有良好的观察效果。 6小的凝胶微型和中型凝胶的电泳一般比大凝胶要快，常用于快速分析。小胶通常要在高电压下电泳(10 V/cm)。应注意电泳槽盛装缓冲液的体积要相对较大。,真核细胞RNA的制备与分析,真核组织总RNA提取(TRIzol试剂法) RNA紫外定性、定量分析 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定,抑制RNase活性是提取RNA的关键 实验中严格控制内源性和外源性RNase的污染。RNase可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。 外源性RNase存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学

16、实验中使用的RNase也会造成污染。这些外源性的RNase可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。 各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNase。,RNA操作中的要求,玻璃器皿均应在使用前于180的高温下干烤6hr或更长时间。 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。 配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37处理12hr以上，然后用高压法除去DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22m滤膜过滤除菌。 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验中手套要勤换。 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。,防止RNA酶污染的措施,焦磷酸二乙