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1、第五章 分子生物学研究方法,分子生物学研究之所以从20世纪中叶开始得到高速发展，其中最主要的原因就是现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。,DNA分子的切割与连接,核酸分子杂交,凝胶电泳,细胞转化,核酸序列分析,基因的人工合成,基因操作,基因的定点突变,PCR扩增等,核心技术,基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。 外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达的过程. 基因工程技术区别于其它技术的根本特征：具有跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘
2、关系的新的寄主生物细胞之中的能力。 本章将在回顾重组DNA技术史上主要事件的基础上，讨论DNA操作技术、基因克隆的常用载体系统以及基因的分离与鉴定等三个环节。,三大成就 ：,1. 40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；,Bacterial Strain,Injection,Results,Living S cells,Living R cells,Heat killed S cells,Heat killed S cells mixed with living R cells,Living S cells in blood sample
3、 from dead mouse,capsule,1928 Frederick Griffith &1944 Oswald Avery Transformation of Streptococcus pneumoniae,1952年Hershey和Chase证实噬菌体DNA侵染细菌实验,2. 50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；,X-ray source,Crystallized DNA,Rosalind Franklin,Maurice Wilkins,Photographic film,1953- Franklin & Wilki
4、ns,Description of the 3-D structure of DNA,Francis Crick & James Watson,Conservative Model,Semiconservative Model,Frank Stahl,Matt Meselson,Parent cell,First replication,Second replication,1958 -Matthew Meselson & Franklin Stahl proved that DNA replication in bacteria follows the semiconservative pa
5、thway,3. 50年代末至60年代，相继提出了“中心法则“和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。,Jacob and Monod,但是，如果没有分离和富集单一DNA分子的技术，科学家就无法对这类物质进行直接的生化分析。,两大技术保证：,1.DNA的体外切割和连接,1962年Arber 发现限制性核酸内切酶，1967Gellert发现了 DNA 连接酶DNA ligase covalently links two DNA strands,Herbert Boyer, Stanley Cohen 1972年获得第一个重组DNA分子,Herbert Boyer,重组
6、DNA实验中常见的主要工具酶,到目前为止，科学家已经几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不连续的片段，再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。,1972 - Paul Berg,Produced first recombinant DNA using EcoRI,EcoRI recognition sites, phage DNA,EcoRI cuts DNA into fragments,Sticky end,SV40 DNA,The two fragments stick together by base pairing,DNA ligase,Recom
7、binant DNA,仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组远不能满足基因研究的需要。 DNA片段在体外不具备自我复制能力，要想得到足够量和足够纯度的DNA，必须将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上（载体上），并转入寄主细胞中进行繁殖。 这就是基因克隆，或分子克隆 。,分子克隆的载体-具备自主复制能力的DNA分子（vector），如病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。,从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。,1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处理后，能有效地吸收噬菌体DNA。,1972年，Cohe
8、n等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞同样能够摄取质粒DNA。,1973 - Boyer, Cohen & Chang,Transform E. coli with recombinant plasmid,Stanley Cohen & Annie Chan,Herbert Boyer,Kanamycin resistance gene,Plasmid pSC101,Tetracycline resistance gene,E. coli transformed with recombinant plasmid,Transformed cells plated onto medium wit
9、h kanamycin and tetracycline,Only cells with recombinant plasmid survive to produce colonies,表明：,（1）像pSC101这样的质粒DNA分子可以作为基因克隆的载体，从而把外源DNA导入寄主细胞；,（2）像非洲爪蟾这样的高等生物的基因也可以被成功地转移到原核细胞中并实现其功能表达；,（3）质粒DNA-大肠杆菌细胞作为一种成功的基因克隆体系，有可能在重组DNA或基因工程研究中发挥重要作用。,2.DNA的核苷酸序列分析技术,DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶学和生物化学的基础上创立并发站起来的一门重要的DN
10、A技术学，这门技术，对于从分子水平上研究基因的结构与功能的关系，以及克隆DNA片断的操作方面，都有着十分广泛的使用价值。,General process of gene engineering,1. 从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。,2. 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。,3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。,4. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。,5. 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗
11、传背景下实现功能表达，研究核酸序列与蛋白质功能之间的关系。,5.2 DNA操作技术,5.2.1 核酸的凝胶电泳,自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，也是现在通用的许多分子生物学研究方法，如： DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图等的技术基础，受到科学界的高度重视。,5.2.1.1 基本原理,一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，
12、叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。就是说，电场强度越大，电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移的速度越快，反之则较慢。由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等，故电泳的迁移率与分子的摩擦系数成反比。 已知摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数，因此，根据分子大小的不同、构型或形状的差异以及所带的净电荷的多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。,在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的，所以，DNA和RNA多核苷酸链又被称为多聚阴离子（polyanions），把这些核
13、酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。,大分子量的DNA 移动的慢,小分子量的DNA 移动的快,电泳缓冲液,阳极,阴极,DNA加样孔,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.250kb之间,聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶，其分辨范围为1个碱基对到1000个碱基对之间,凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关，凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙
14、越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。,在凝胶电泳中，加入适量溴化乙锭（ethidium bromide，简称EtBr）染料对核酸分子进行染色，然后将电泳标本放置在紫外光下观察，可十分灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05g的微量DNA，也可以被清晰地检测出来。,在紫外线的照射下结合溴化乙锭的DNA分子发出荧光,称样,溶解,加热,制板,倒胶,电泳操作基本程序,取样,点样,电泳,检测,结果,5.2.2 核酸的分子杂交,将带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起，其相应的同源区段就会退火形成双链结构。如果退
15、火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子就被称为杂种核酸分子。,不同温度下DNA的构型变化一,DNA/DNA的杂交作用，可以用来检测特定生物有机体之间是否存在着亲缘关系，而形成DNA/RNA间杂种分子的能力可被用来揭示核酸片段中某一特定基因的位置。,不同温度下DNA的构型变化二,在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的，因此，核酸杂交也被称为“DNA印迹杂交”。,Southern Blotting E.M. Southern于1975年首先设计出来的。,材料：尼龙滤膜 硝酸纤维
16、素滤膜 二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）,步骤：,第一，将分离的核酸样品转移到固体支持物滤膜上核酸印迹转移,电泳凝胶核酸印迹法、,斑点和狭线印迹法、,菌落和噬菌斑印迹法,第二，是将具有核酸印迹的滤膜与带有放射性或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交,杂交模式图,Southern Blotting的过程 1.碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的DNA 2.通过电泳液的移动转移胶中的DNA 3.固定胶中的DNA 4.预杂交和杂交（放射性和荧光检测） 5.结果检测,在理想条件下，应用放射性同位素标记的特异性探针和放射自显影技术，即便每带电泳条带仅含有2ng的DNA也能被清晰地检测出来。由于放射性同位素对人体的危害，近年来又发展了荧光法检测杂交信号的技术，虽然灵敏度略低于同位素法，却使核酸杂交实验变得更为安全。,常用的荧光染料：,C5、C3等,2.Northern blotting（诺赛恩RNA印迹技术） 是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交
