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1、分子克隆,安普利试剂研发部 胡师凯,主要内容,（一）.基本概念 （二）.分子克隆技术的基本过程 1.概述 2.分子克隆中常用工具酶 3.基因克隆常用载体 4.目的基因的分离与制备 5.目的基因的体外重组 6.重组子导人宿主细胞 7.阳性重组子的筛选和鉴定,（一）.基本概念: 1. 分子克隆：是在体外对DNA分子按照既定的目的和方案进行人工重组，将重组分子导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA分子大量复制，并使受体细胞获得新得遗传特征的过程。 2. Dalton，bp，nt 道尔顿（Dalton，Dal，Da，D）：分子量的单位，蛋白质是大分子，所以常用kDa（千道尔顿）来
2、表示。 碱基对（ bp） base pair，1 kb就是1000个碱基对； nt核苷酸 nucleotide 。,（一）.基本概念,3.保护碱基 在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。,（一）基本概念,4.T-A克隆： 利用Taq酶在PCR产物3末端有加上一个A的特性，使得Taq酶的PCR产物或经过Taq酶加A的PCR产物，和一个人工加上一个3末端具有1个T的载体
3、进行连接，由于突出末端可以互补，这样可以大大提高目的基因和载体的连接效率。,（一）基本概念,5.RNA酶H活性： 降解杂合在DNA链上的RNA的磷酸二酯键。可消化mRNA。 6.载体： 是指能在连接酶作用下和外源DNA片段或基因连接，并运送DNA分子进入受体细胞的DNA分子。,（一）基本概念,7.质粒(plasmid) 细菌染色体外的遗传物质，为环形闭合的双股DNA，存在于细胞质中，质粒编码非细菌生命所必须的某些生物学性状，如性菌毛、细菌素、毒素和耐药性等。质粒具有可自主复制、传给子代、也可丢失及在细菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有关。,（一）基本概念,8.F因子 又称致育因子或性因子。是
4、E.coli等细菌中决定性别的质粒，约等于2%核染色体DNA的小型共价闭合环状DNA （cccDNA通过共价键结合形成的封闭环状DNA分子。） 。分子量为6.2107 Da，94.5Kb。其中有1/3的基因（tra区）与接合作用有关。,（二）分子克隆的基本过程 1.概述 （1）.分：得到目的基因 （2）.切：将目的基因和载体用适当的限制性内切酶切割。 （3）.接：将目的基因和载体连接，形成重组子。 （4）.转：将重组子转到适当的宿主细胞中。 （5）.筛：筛选出含有正确重组子的宿主细胞，扩增。,（二）分子克隆的基本过程,2.分子克隆中常用工具酶 分子克隆中对DNA、RNA分子的操作常涉及到一系列
5、酶促反应，这些酶是进行基因克隆时必备的基本工具。,分类 （1）. 使核酸降解的核酸酶类： 核酸内切酶、核酸外切酶。 （2）.催化核酸合成的酶类： DNA聚合酶，RNA聚合酶，连接酶，逆转录酶。 （3）. 核酸修饰酶类； 甲基化酶，激酶，基团转移酶， 磷酸酶等。,（1）. 使核酸降解的核酸酶类：,. 限制性核酸内切酶概念的提出及背景： 20世纪30年代初，微生物学家发现，微生物的噬菌体不能交叉感染。如E.coli K株的噬菌体只能感染E.coli K株，不能感染其他株，反之亦然。这种现象成为限制现象。 但某些被菌体限制的噬菌体群中，有少数能幸存下来，并在菌体中繁殖，这种现象称为修饰现象。,是由细
6、菌自己产生的一种能识别双链DNA中的特定序列，并以内切方式水解核酸中磷酸二酯键的核酸内切酶。在细菌体内，这种内切酶可以分解外源性的DNA物质，例如病毒等；而细菌本身的DNA同一识别序列中的某些碱基被甲基化所保护。,.限制性核酸内切酶(restriction endonuclease，RE)的定义, .限制性核酸内切酶的分类：,按照限制性核酸内切酶对辅助因子的需求与否，以及切割DNA链的特点，将已发现的限制性内切酶分为3种类型：I、型。,型限制性内切酶实际应用价值最大，这是因为： 型酶只具有限制性活性，无甲基化修饰活性； 对DNA的切割要求严格的序列作为靶位点，切割精确； 此类酶作用时只需要Mg
7、2+参与。无需ATP。 因此型限制性核酸内切酶是基因工程中剪切DNA分子的常用工具酶，被誉为分子生物学家的手术刀。, 限制性内切酶的命名 目前已广泛采用HOSmith和DNathams于1973年提出的命名系统：限制性内切酶第一个大写字母来自细菌的属名(genus)，第二、三个小写字母来自种名(species)，第四个字母代表菌株(strain)：如果从一种菌株中发现了多种限制酶，则根据发现和分离的顺序用罗马字母表示。例如从流感嗜血杆菌D株中分离到的限制酶分别表示为Hind I、，EcoR I。,.限制性内切酶的作用特点： 有严格的识别、切割的DNA序列，并以内切的方式水解双链DNA分子中的磷
8、酸二酯键，产生的DNA片段5端为P，3端为OH。 识别序列一般为46个碱基对，并以切割序列的正中作为轴心，成180反向重复(inverted repeat)。这种结构也称为回文结构(palindrom)。,切割后产生平头或粘性末端。 型RE酶只需Mg2+， 不需ATP。,限制性内切酶(Restriction Endonuclease),.限制性内切酶使用时的注意事项,. 要求较纯的底物DNA。 . Mg2+和Tris-HCl缓冲体系，并且大多数内切酶活性pH范围在7276之间； . 同时反应体系中不能含有酚、氯仿、乙醚、SDS以及大于10mmolL的EDTA； . 对离子强度的要求分为3个级别
9、， 高盐 (100mmolL NaCl)， 中盐(50mmolL NaCl)， 低盐(010mmolL NaCl)。,.在酶反应缓冲体系中均添加有二硫苏糖醇或-巯基乙醇，以稳定酶活性防止氧化。 .在具体试验操作时应在低温或冰浴条件下完成。,2.分子克隆中常用工具酶,（2）.催化核酸合成的酶类： 分子克隆常用的DNA聚合酶： 依赖DNA的大肠杆菌DNA聚合酶I。 Klenow片段。 T4噬菌体DNA聚合酶。 T7噬菌体DNA聚合酶。 经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶。（测序酶） 耐热DNA聚合酶。 依赖RNA 的DNA聚合酶。（逆转录酶）,DNA聚合酶I：,DNA聚合酶I是Kornberg从大肠杆
10、菌中发现的第一个DNA聚合酶，商品名称为kornberg酶，分子量109KD。此酶是一个多功能酶，包括3种酶活性： 5-3聚合酶活性：催化单核苷酸聚合到DNA的3-OH末端，使DNA链从5-3延伸； 5-3外切酶活性：即从游离的5末端降解双链DNA或单链DNA成为单核苷酸 3-5外切酶活性。 另外该酶还具有RNA酶H活性。,DNA聚合酶I作用条件：,4种dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、Mg2+ DNA作为模板，单链DNA或有缺口的双链DNA均可； 需要具有游离3-OH的引物或缺口的3末端,.TaqDNA聚合酶,TaqDNA聚合酶是一种依赖DNA的单亚基耐热DNA聚合酶，分子
11、量约为94KD。该酶最初由极端嗜热水生菌Thermus aquaticus中提取并纯化，目前已能通过基因工程方式大量生产。,TaqDNA聚合酶的应用,TaqDNA聚合酶主要用于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)中，能以DNA为模板，从结合在模板上的引物出发，以dNTP为原料，按碱基配对方式，从5-3方向合成新的DNA链。TaqDNA聚合酶在7075时具有最佳的生物活性，随着温度的降低，酶活性明显下降。同时此酶缺乏3-5外切酶活性，因而无校正功能。,.DNA连接酶：,催化双链DNA中相邻碱基的5磷酸和3羟基间磷酸二酯键形成的酶，称为DNA连接酶(DNA
12、ligase)。DNA连接酶主要有两种： T4噬菌体DNA连接酶 大肠杆菌DNA连接酶,大肠杆菌的DNA连接酶,T4噬菌体DNA连接酶,T4DNA连接酶最早是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中发现并分离的，分子量68kDa。,特点：,A. 催化双链DNA平头末端或黏性末端相邻核酸的5-P和3-OH连接反应。 B. 催化双链RNA和杂交双链RNA/DNA连接，但不能催化单链核酸的连接。 C. 可修补在双链DNA、RNA或DNA/RNA杂种分子中的单链切口。,大肠杆菌DNA连接酶,特点： A.连接双链DNA中一条链上的缺口催化 B.存在的互补粘性末端的DNA片段需 NAD+ 上述情况下可代替T4DNA连
13、接酶，它产生 的背景低，准确性高。 C.连接平头末端DNA分子需聚乙二醇或 Ficoll,.反转录酶：,能以RNA为模板合成DNA的DNA聚合酶称为反转录酶(reverse transcriptase，RT)，合成的DNA产物称为互补DNA(complementary DNA，cDNA)。,反转录酶的作用特点：,反转录酶以单链RNA或单链DNA为模板，以4种dNTP及游离3-OH为引物，按5-3方向合成DNA； 可用于cDNA第一链和第二链的合成，同时逆转录酶有5-3和3-5RNA外切酶活性(3-5切活性又称RNA酶H活性)，3-5RNA外切酶活性可用于特异降解RNA/DNA杂交分子中RNA部
14、分。,此酶缺乏起校正作用的3-5 DNA核酸外切酶活性，催化的聚合DNA反应会产生一定的错配率。 常用的逆转录酶有禽类成骨细胞性白血病病毒(AMV)逆转录酶和Moloney小鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶 。,反转录酶的作用特点：,.末端脱氧核苷酸转移酶(末端转移酶),末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deosynucleotidyl transferase）多从小牛胸腺中分离出，催化多个脱氧核苷酸依次加到DNA 3末端。,末端脱氧核苷酸转移酶的作用： 末端转移酶常用于给载体或cDNA加上互补的多聚尾巴，构建人工粘性末端；也用于DNA分子3端标记。, .碱性磷酸酶：,碱性磷酸酶(al
15、kalinephosphatase)来源于大肠杆菌和牛小肠，能水解DNA、RNA以及脱氧核糖三磷酸(dNTP)上的5磷酸根。,碱性磷酸酶应用：,在分子克隆的连接反应中预先处理载体DNA片段，以去除5-P，防止载体重新自体连接，以提高重组效率； 用32P标记5末端时，用此酶去除5-P，再用激酶对5末端进行同位素标记； 作为化学发光物测定或其他检测系统的指示酶。,（二）分子克隆的基本过程,3.基因克隆常用载体 目前用于基因克隆的载体种类繁多，包括在大肠杆菌中使用的质粒、噬菌体载体、酵母菌质粒载体以及动、植物病毒载体等,载体必须具备以下基本条件：,.载体必须有自我的复制子，能借助宿主细胞的复制和调控
16、系统对携带的目的基因进行复制和增殖。 .载体分子必须具备多种限制性内切酶的识别位点(多克隆位点)，易于外源DNA分子与载体连接及重组。 .载体及宿主细胞应具有多个利于选择和筛选的遗传表型或标志，包括抗药性、营养缺陷型、噬菌斑形成及显色反应等。,载体必须具备以下基本条件：,.载体必须有足够的容量以容纳外源DNA片段，同时载体分子应具有拷贝数高、易与宿主细胞的DNA分子分离并易提取、抗剪切力强等特点。 .表达型载体还应具备与宿主细胞相适应的启动子、前导序列、增强子等调控元件。,.质粒载体：,.质粒载体：,质粒是细菌染色体外的遗传单位，是一种双链环状的DNA分子，大小在1200kb之间。质粒自身含有复制起始点，与相应的顺式调控元件组成一个复制子(replicon)，能利用细菌的酶
