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1、人体机能学实验,有机磷酸酯类中毒和 解救及胆碱酯酶活性测定,201550708 及廷宇,1. 实验目的,（1）观察有机磷酸酯类中毒的症状及阿托品和解磷定的解救效果 （2）学习胆碱酯酶活性的测定方法，观察中毒前后及用不同药物解救后胆碱酯酶活性的变化,有机磷酸酯中毒原理,有机磷酸酯类进入人体后，其含磷基团中亲电性的磷与但见酶酯解部位丝氨酸羟基中的亲和性氧进行共价键结合，生成磷酰化胆碱酯酶复合物。该复合物使胆碱酯酶活性难以恢复，从而使乙酰胆碱大量积聚，产生中毒症状。早期用胆碱酯酶复活药可部分恢复胆碱酯酶的活性，若抢救不当或中毒时间过长，胆碱酯酶一旦老化，再用胆碱酯酶复活药也作用不大。所以，一旦中毒，
2、必须迅速抢救并尽早使用胆碱酯酶复活药,阿托品、解磷定解救原理,阿托品 抗胆碱药阿托品的作用机制为竞争性拮抗乙酰胆碱或拟胆碱药对M受体的激动作用，对M样症状有效。,磷酰化胆碱酯酶,复活的胆碱酯酶,磷酰化碘解磷定,复合物,复活的胆碱酯酶,实验材料,实验动物：家兔，2.5-3.0kg，雌雄均可。 实验药品 5%敌百虫 0.1%硫酸阿托品 2.5%解磷定 1%肝素 10%草酸钾 0.007M氯化乙酰胆碱，1M盐酸羟胺，3.5N氢氧化钠，4N盐酸，0.37M三氯化铁，磷酸缓冲液（pH7.2）,实验器材：婴儿秤，测瞳尺，注射器（2ml、5ml、10ml、20ml），头夹，滤纸，干棉球，比色杯，烧杯，试管架
3、，10ml试管，微量移液器，漏斗，采血瓶，试管刷等。 超级恒温水浴，722型分光光度计,实验方法,1. 取家兔，称重，分组，观察： 活动情况 呼吸（呼吸频率、有无呼吸困难、呼吸道分泌物） 瞳孔大小（测瞳尺测量直径，注意光线的影响） 唾液分泌：是否正常 大小便：有无失禁 肌张力：是否正常 肌震颤：有无 采取正常家兔心脏血样：1.0ml放入1号采血瓶 （注射器肝素抗凝；采血瓶草酸钾抗凝）,2. 复制急性有机磷酸酯类中毒模型： 耳缘静脉注射敌百虫1.5ml/kg，10-15分钟出现中毒症状 观察中毒症状，方法体同上 采取中毒后家兔心脏血样1.0ml放入2号采血瓶 注意： 采血时间在15-20分钟内或
4、中毒症状明显时进行，勿迟亦勿早,3. 有机磷酸酯类中毒解救： 甲组：阿托品1.0ml/kg 乙组：解磷定4.0ml/kg 10-15分钟症状缓解 采取解救后家兔心脏血样1.0ml放入3号采血瓶 注意：采血时间为药物解救后的20分钟左右为宜 （注射器肝素抗凝；采血瓶草酸钾抗凝）,4. 胆碱酯酶活性测定：胆碱酯酶活性测定步骤见表1. 表1 家兔血浆胆碱酯酶活性测定方法,操作注意事项： 1）每加入一种试剂都要混匀，加血样时要将3个小瓶中的血样 2）第二次水浴30min时用盐酸羟胺和氢氧化钠等容量混合配制碱性羟胺（用前20min配制） 3）加入各种试剂的顺序不能颠倒 4）过滤要充分，滤液澄清透明 5）
5、加样结束后各试管的容量相同,722分光光度计比色测定 蒸馏水调零A3+（A2A1）A样为分解的Ach理论上所产生的光密度值 选择=480nm 测出光密度A1A6 计算酶活性值、活性百分数 ChE活性 酶活性百分数,说明： A3A1为加入的7M Ach的光密度值 对照、对照、对照为无血零点管、有血零点管、标准Ach管,胆碱酯酶活性测定的原理操作方法及注意事项,（三）胆碱酯酶活性测定的原理 在一定的温度、pH值和时间的条件下，水解乙酰胆碱的量和AChE活性成正比。因此，在一定量的血液中，加入一定量的Ach，在一定条件下反应一定时间，测定剩余Ach的量，即可推算出水解的Ach的量，从而推算出胆碱酯酶的活性。 测定剩余Ach的反应：,盐酸羟胺与氢氧化钠反应释放出游离羟胺 NH2OHHCl+NaOH NH2OH+NaCl+H2O 剩余Ach与游离羟胺作用，生成羟肟酸 (CH3)3N-(CH2)2OCOCH3+NH2OH CH3CONHOH+ (CH3)3N-(CH2)2 羟肟酸在酸性环境下和三氯化铁生成褐色络合物羟肟酸铁 3CH3CONHOH+FeCl3 (CH3CONHO)3-Fe+3HCl,
