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1、1Endostatin 抑制人卵巢癌细胞生长及其在裸鼠皮下移植瘤中的作用作者：刘梅梅，隋丽华，李佩玲，程丽【关键词】 抑制【关键词】 卵巢癌；移植瘤；内皮抑素；Bcl2/Bax0 引言我们采用人浆液性乳头状囊腺癌 SKOV3 细胞系及其荷瘤鼠为研究对象，研究Endostatin 对其增殖、凋亡的影响及作用机制，为其应用于卵巢癌的临床治疗提供试验依据.1 材料和方法1.1 材料选用雌性 68 周龄 BALB/c 裸鼠 10 只，SPF 条件下饲养. 人浆液性乳头状囊腺癌细胞系 SKOV3 由北京医科大学人民医院妇产科馈赠，用 RPMI1640（含 10 g/L 小牛血清）培养基于 37, 50
2、mL/L CO2 条件下培养. Endostatin 购自烟台麦得津生物工程公司，置于 4保存. 抗 Bcl2，抗 Bax mAb 及 SP 试剂盒购自北京中衫试剂公司.1.2 方法1.2.1MTT 法测定 SKOV3 细胞生长抑制率分组：PBS 对照组（10 mmol/L PBS）和实验组（0.1，1.0，5.0，10.0 和 15.0 mg/L Endostatin）. SKOV3 细胞以 5107/L 密度接种于 96 孔板，每组设定 6 个平行孔，并设定空白对照. 细胞贴壁培养 24 h 后，分别加入上述不同浓度的药物，作用 48 h 后测定细胞A490 值. 计算 Endostati
3、n 对卵巢癌细胞 SKOV3 生长的影响和抑制情况. 抑制率=（PBS 对照组 A490-药物组 A490）/PBS 对照组 A490100%.1.2.2 透射电镜下观察 SKOV3 细胞凋亡实验组 SKOV3 细胞作用不同时间（24，48 和 72 h）后，消化离心，用 4，0.25 g/L 戊二醛固定，0.1 g/L 锇酸后固定，系列乙醇丙酮脱水，环氧树脂包埋，制成超薄切片，透射电镜下观察细胞凋亡形态.1.2.3 免疫细胞化学检测凋亡调控相关蛋白质表达的变化实验组 SKOV3 细胞爬片培养作用不同时间（24，48 和 72 h）后，丙酮室温固定 10 min，进行免疫细胞化学 SP 法染色
4、. 按说明书操作，DAB 显色. 结果判定：以细胞核和细胞质2呈明确的棕黄色为阳性染色.1.2.4Endostatin 对裸鼠肿瘤生长的影响1.2.4.1 裸鼠皮下瘤模型的建立已培养的 SKOV3 细胞，使细胞浓度达到51010/L，从裸鼠右肩胛部近腋窝处进针，每只裸鼠注射一点，约 1107 个细胞. 观察接种部位有无渗出、肿瘤生长及裸鼠状况，待皮下瘤体积约 100 mm100 mm100 mm 时分组实验.1.2.4.2Endostatin 对卵巢肿瘤的治疗作用将裸鼠随机分成治疗组和对照组，每组 5 只. 实验组裸鼠每日皮下注射 Endostatin 20 mg/kg，注射部位远离肿瘤形成部
5、位，对照组以同样方法每日注射 PBS. 每日测量肿瘤长度和宽度，计算肿瘤体积. 治疗 21 d 后将裸鼠处死，剥离出皮下肿瘤，备用.1.2.5Endostatin 对肿瘤组织中细胞凋亡的影响将切下的瘤组织置于 0.25 g/L 戊二醛中，4固定，电镜观察瘤组织中细胞形态的改变和观察细胞是否出现凋亡小体.1.2.6Endostatin 对瘤组织中 Bcl2 及 Bax 蛋白和 mRNA 表达的影响常规免疫组织化学法检测瘤组织中 Bcl2 及 Bax 蛋白的表达情况. 将切下的瘤组织置于液氮中，采用常规 RTPCR 方法观察 Endostatin 对 Bcl2 及 Bax mRNA 表达的影响.
6、引物由上海生物工程有限公司合成，序列引自文献1.统计学处理： 数据均以 xs 表示，采用 Students t 检验.2 结果2.1Endostatin 对 SKOV3 细胞生长的抑制作用不同浓度的 Endostatin 处理SKOV3 细胞 48 h 后，与对照组相比，SKOV3 的生长均受到不同程度的抑制. 比较A490 值结果显示，细胞 PBS 对照组、0.1，1.0 和 5.0 mg/L Endostatin 组之间差异无统计学意义（P0.05） ，而 10.0 和 15.0 mg/L Endostatin 组的 A490值分别与前 4 组比较，其差异有统计学意义（P0.01）.2.2
7、Endostatin 对 SKOV3 细胞凋亡的影响在透射电镜下观察，Endostatin 处理 SKOV3 后，可见细胞皱缩，胞核固缩，细胞质内可见线粒体嵴絮状变，出现凋亡细胞，随 Endostatin 作用时间延长和剂量的增加，上述变化越来越明显(图 1).2.3Endostatin 对 SKOV3 细胞凋亡调控相关蛋白表达的影响 SKOV3 细胞中Bcl2 和 Bax 蛋白表达均定位于胞质和胞核. 与对照组相比，Endostatin 处理后的 SKOV3 细胞中，Bcl2 和 Bax 蛋白表达未见明显增强和减弱，并且在Endostatin 作用时间和剂量上亦无明显相关性.2.4Endos
8、tatin 对裸鼠皮下移植SKOV3 肿瘤生长的影响 Endostatin 治疗组肿瘤生长缓慢，治疗 15 d 后，肿瘤体积明显小于对照组(P0.05)，对肿瘤的最大抑制率可达到 90.4%，但未发现3Endostatin 有明显的消瘤作用.2.5Endostatin 对裸鼠肿瘤组织中细胞凋亡的影响透射电镜下，Endostatin治疗组可见多个凋亡细胞，胞质可见完整的细胞器，细胞质浓缩或裂解成质膜包绕的碎片. PBS 对照组未见明显凋亡细胞，但可见坏死细胞，细胞器结构多被破坏.2.6Endostatin 对裸鼠肿瘤组织中 Bcl2 及 Bax 蛋白和 mRNA 表达的影响2.6.1 免疫组织化
9、学法 Endostain 治疗组肿瘤组织中 Bcl2 蛋白表达含量明显低于对照组，而 Bax 蛋白在两组中均有阳性表达，但其表达含量在两组间未见有明显的差异(图 2).2.6.2RTPCR 法与 PBS 对照组相比，Endostatin 下调裸鼠肿瘤组织中 Bcl2 mRNA 的表达，而对 Bax mRNA 的表达无明显影响(图 3).M：Marker DL2000；1,2,3： PBS 对照组；4,5,6：Endostatin 治疗组.图 3 裸鼠肿瘤组织中 Bcl2 mRNA 的表达3 讨论本研究结果提示，Endostatin 具有抑制人卵巢癌细胞 SKOV3 增殖的作用. 但 Endos
10、tatin 抑制细胞增殖作用是否为内皮依赖性的，目前尚无定论. Endostaitn 对鼠的移植实体瘤和霍奇金淋巴瘤具有明显的治疗作用2. 在鼠实验中，重组 Endostatin 可以抑制原发和继发瘤生长，且反复应用可以预防肿瘤复发3. 我们研究发现 20 mg/kg 剂量的人 Endostatin 可抑制裸鼠 SKOV3卵巢癌移植瘤生长，抑制率达 90.4%，但不具有明显消瘤作用. 有研究结果显示20 mg/kg 的 Endostatin 可抑制肿瘤生长率达 94.3%2. 这些结果差别可能是Endostatin 蛋白产生来源不同、蛋白应用方式不同及不同肿瘤具有不同的生物特性所致. 我们采用
11、了电镜的方法证实了一定浓度的 Endostaitn 可诱导 SKOV3细胞凋亡. 但是在 SKOV3 细胞系中，未发现其对 Bcl2 和 Bax 表达含量有明显的调节作用. 在荷瘤鼠的体内实验中，Endostaitn 治疗组的肿瘤组织中 Bcl2 的表达含量下调，而 Bax 表达含量仍然无明显变化. 由此推断，在卵巢癌 SKOV3 细胞系中，Endostaitn 可能并不通过调节 Bcl2/Bax 表达含量而引发细胞的凋亡；而在卵巢癌组织中，Endostaitn 能够促进细胞凋亡、抑制肿瘤生长，Bcl2/Bax 表达含量比值的变化可能是其作用机制之一. 在卵巢癌细胞系和卵巢癌组织中Endost
12、aitn 作用机制的差异，可能存在着 Endostaitn 作用内皮细胞特异性方面的影响，但此结论尚需大样本的研究加以证实.【参考文献】1 Park WH, Seol JG, Kim ES, et al. Arsenic trioxide mediated growth inhibition in MC/CAR myeloma cells via cell cycle arrest in association with induction of cyclindependent kinase inhibitor, p21 and apoptosisJ. Cancer Res,2000,60(1
13、1):3065-3071.42 Bertolini F, Fusetti L, Mancuso P, et al. Endostatin, an antiangiogenic drug, induces tumor stabilization after chemotherapy or antiCD20 therapy in a NOD/SCID mouse model of human highgrade nonHodgkin lymphomaJ. Blood, 2000, 96(1):282-287.3 Vergani V, Garofalo A, Bani MR, et al. Inhibition of matrix metalloproteinases by overexpression of tissue inhibitor of metalloproteinase2 inhibits the growth of experimental hemangiomasJ. Int J Cancer, 2001,91(2):241-247.
