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1、1cyclinD1、P16、P27 联合判断癌症患者病情的研究作者：黄金吉利娜张永亮陈妍裴毅 【摘要】目的:通过分析不同病期血液中淋巴细胞 cyclinD1、P16、P27 的表达情况，探索这些指标在癌症发生发展变化中的临床意义。方法:回顾性分析 86例经病理诊断的癌症患者的血液学 cyclinD1、P16、P27 的表达情况，比较稳定和进展组间 cyclinD1、P16、P27 表达的差异性（其中 52 例稳定、34 例进展） ，计量资料以(XTX-S)表示，采用两独立样本 t 检验，计数资料采用卡方检验，p0.05） ，外周血淋巴细胞cyclinD1、P16 的表达进展组均显著高于稳定组（
2、p0.05） ；Logistic 回归分析，cyclinD1对病情的预测有统计学意义（p0.05） 。结论:cyclinD1、P16 的高表达提示癌症患者病情可能进展，其中 cyclinD1 的增高对病情的预测敏感性高，P27 的变化对癌情检测没有明确的临床意义。 【关键词】癌症患者;cyclinD1;P16;P27;病情预测 恶性肿瘤的形成是多步骤、多基因改变的积累过程，涉及到多种癌基因的激活和抑癌基因的失活，单一的一种指标已不能确切的判断肿瘤的发生发展，对多基因的综合研究势必能更准确的反映肿瘤的生长和机体的整体状况1。本研究试图从细胞周期的失控调节方面，寻找能较准确预测肿瘤病人病期及判断预
3、后情况的指标。 1 材料与方法 1.1 临床资料:收集 2008 年2009 年间入住我科治疗的 86 例经病理诊断的癌症患者，其中 52 例为经标准抗肿瘤治疗 4 个周期以上缓解后一直稳定 1 年未见癌转移的患者，男 25 例,女 27 例，中位年龄 60 岁（4176 岁） ；另 34 例为进展期的癌症患者，其中男 23 例，女 11 例，中位年龄 62 岁（3082 岁） 。所有患者均排除影响外周血淋巴细胞水平的疾病（如炎症、过敏、自身免疫疾病等)。 1.2 分组:稳定组：经标准治疗至少 4 个周期的癌症患者，病情持续稳定 1年未发生转移。按实体瘤疗效评定。 进展组：初次发病；或出现新的
4、转移灶；和/或有可观察肿块增大25%，肿瘤标志物任何一项增高(+)以上并持续 3 个月以上者。 1.3 主要试剂和仪器:鼠抗人 cyclinD1、P16、P27 单克隆抗体(1：100)购自福州迈新生物技术开发有限公司，异硫氰酸荧光素(F1TC)羊抗鼠 IgG(1：400)购自北京华美生物技术开发有限公司，流式细胞仪为美国 BD 公司 FACS420 型。 1.4 实验方法。 1.4.1 取样。稳定组在治疗 4 个周期后经影像学和实体瘤疗效评价达稳定时，抽血；进展组经影像学和实体瘤疗效评价为进展时，抽血。在清晨、空腹、静卧条件下,取外周血 2mL,注入盛有 0.01mL0.1%乙二胺四乙酸二钠
5、抗凝剂的试管中混匀. 21.4.2 实验步骤。取抗凝外周血 2ml，用国产淋巴细胞分离液分离人抗凝外周血中的淋巴细胞，用 PBS 洗涤，洗涤后用 70乙醇固定过夜。离心去除乙醇，用 PBS 洗涤，调节细胞浓度为 1106/ml 。穿透，加入一抗(使用鼠抗人cyclinD1、P16、P27 单克隆抗体)、二抗(FTTC-IgG 抗体)，加入 1mlPBS 缓冲液，并设同型阴性对照样品放在 04环境中准备上机检测。l5mW 氩离子激光激光波长 488nm。用 CellGuest 软件自动取每个样品104 个细胞并分析结果，记录样品的荧光指数(FI 值)。 1.5 统计方法。用 SPSS13.0 软
6、件包进行统计学处理，实验数据计量资料以(XS)表示，进行正态及方差齐性检验，结果采用两独立样本 t 检验，计数资料的比较采用卡方检验，p0.05 为差异有统计学意义。采用 Logistic 回归分析筛选年龄、性别及 cyclinD1、P16、P27 中与预测疾病病情相关的因素。 2 结果 2.1 稳定组和进展组年龄、性别差异的比较分析。分别采用两独立样本 t 检验及卡方检验对 52 例稳定及 34 例进展的癌症患者进行年龄、性别的比较，分析年龄、性别因素对癌症患者疾病的影响，见表 1。 注：分组中，0 为稳定组，1 为进展组，p0.05 差异有统计学意义。 表 2 不同分组性别的比较 注：p0
7、.05） 。 2.2 稳定组和进展组外周血淋巴细胞中 cyclinD1、P16、P27 表达水平的比较分析观察稳定组和进展组外周血淋巴细胞中 cyclinD1、P16、P27 的表达水平，采用独立样本 t 检验，分析两组中各指标差异有无统计学意义，见表 3。 注：分组中，0 为稳定组，1 为进展组。 “*”表示有统计学意义，p0.05。 表 3 的结果示：外周血淋巴细胞 cyclinD1、P16 的表达在稳定组和进展组之间均存在差异性（p0.05） 。2.3 外周血淋巴细胞中 cyclinD1、P16、P27 表达水平的相关性分析 采用 Pearson 相关分析 cyclinD1、P16、P2
8、7 各指标的相关性，见表 4。注：“*”表示相关系数有统计学意义，p=0.0000.05。 表 4 的结果示：外周血淋巴细胞 cyclinD1、P16 之间成正相关，相关系数为0.73（p0.05） 。 2.4 疾病病情认知的多因素分析。对以上判断疾病病情有意义的单因素进一步做 Logistic 回归分析，筛选最能预测疾病病情的因素，见表 5 3表 5 的结果示：cyclinD1 进入回归方程，cyclinD1 对疾病病情的判断有统计学意义（p0.05） 。 3 讨论 随着对细胞周期调控认识的不断深入，出现了“癌症可能是一类细胞周期疾病（cellcycledisease） ”的观点2。近来的研
9、究已表明，细胞周期调节失控是肿瘤发生、发展中重要的分子事件3。 任何因素导致细胞周期中的正负调节因子：细胞周期蛋白(cyclin)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白(CKI)失去平衡，出现 cyclin 过表达或 CKI 失表达、失活均可能引起细胞增殖失控产生肿瘤。cyclinD1 是细胞周期蛋白中一种重要的正性调节因子，与 CDKs 结合促进细胞从 G1 期进入 S 期，而 P16、P27 是 CKIs家族中重要的负性调节因子，主要阻抑细胞于 G1 期，防止细胞冲破 G1S 限制点过度增值，阻止肿瘤形成4。 近年来，大量研究者从基础医学到临床各个角度进行研究，众多学者发现外周血循环肿瘤标志物及
10、免疫系统相关抗原的分子生物学检测能够较好并较早的反映机体肿瘤组织的生物学行为58，鉴于对肿瘤浸润淋巴细胞的检测受到标本的限制，外周血淋巴细胞的易抽取、患者易接受及检测方便和可动态观察等优越性，本文从外周血淋巴细胞表达抗原的变化角度，探讨抗原的变化与肿瘤临床生物学进展的关系。 在人类的甲状腺癌、乳腺癌、食管癌以及直肠癌中均发现 CyclinD1 基因扩增和蛋白过度表达，提示 CyclinD1 基因和蛋白的表达异常与肿瘤的发生相关9,10。本研究显示 52 例稳定及 34 例进展期的癌症患者外周血淋巴细胞中，cyclinD1 蛋白进展组明显高于稳定组（p0.05） ，提示 cyclinD1 蛋白增
11、高时，可能预示肿瘤患者的病情进展，肿瘤生长较快。 在多种肿瘤组织中，都可以见到 p16 蛋白失表达11,但 p16 异常的发生率在不同组织起源的肿瘤中差异较大。有学者认为 p16 变异在胃癌中频发，也有学者认为并不常见，另有学者却认为 p16 在胃癌中的表达反而增高12。本研究显示 52 例稳定及 34 例进展期的癌症患者外周血淋巴细胞中，P16 蛋白进展组明显高于稳定组（p0.05） ，可能由于病例数较少，或是组织来源的差异性，本指标对癌情的检测目前没有明确的临床意义，还有待于进一步观察。 本文表 2 中对 cyclinD1、P16、P27 三个指标的相关性进行分析，结果显示：外周血淋巴细胞
12、 P16、cyclinD1 之间成正相关，相关系数为 0.73（p0.05） ，提示肿瘤细胞中 cyclinD1 过表达时，P16 也将升高，这可能与P16 将竞争性结合 CDK4/6，阻止肿瘤细胞的过增长，但表 1 结果，cyclinD1、P16 的过表达，均提示机体的病情可能恶化，并没有出现cyclinD1、P16 并行增高时机体处于稳定的状态，这可能与二者的升高程度或其4对疾病的影响程度有进一步的关系。 为了探讨各因素反应疾病病情的具体作用和程度，本文对判断疾病病情有意义的单因素 cyclinD1、P16 进一步做 Logistic 回归分析，筛选对判断疾病病情作用较大的因素。结果显示：
13、cyclinD1 对病情的预测有统计学意义，而 P16 对疾病病情的判断无统计学意义，即考察因素中，cyclinD1 指标反映疾病进展的情况优于对 P16 指标的考察，cyclinD1 增高时，伴或不伴 P16 的增高，均提示患者病情进展的可能性较大。 综上，癌症患者病情进展时 cyclinD1、P16 会出现不同程度的增高，但cyclinD1 的增高最有参考价值，cyclinD1 增高提示近期肿瘤细胞分裂增殖较快，癌症患者预后不良的可能性大。 参考文献 1孙咏红,姜春萌.细胞周期调控因子 cyclinD1、p27、p16 在大肠癌中的表达.硕士学位论文,2007,129 2曾益新.肿瘤学M.
14、北京:人民卫生出版社,2003.151152 3南克俊，景钊.p27 与消化道肿瘤及其应用前景.国外医学肿瘤学分册，2004，31(1):63 4周琨,金东岭,田珂,时志民.胃癌中 p16,p27kip1 和 CDK4 表达的比较及其意义J.现代肿瘤医学；2005,13(5):624626 5刘波,金秀国,刘晓光,王惠军.胃癌患者肿瘤组织和外周血中细胞毒性 T细胞的相关性分析J.检验医学 2008,23(5):472474 6任晓辉，裴毅.胃肠道癌术后患者外周血淋巴细胞 P16、cyclinD1 异常表达的临床意义J.中国医药导报.2009,6(12):1214 7吴天鹏，张孝斌，熊治国等，膀胱肿瘤患者外周血淋巴细胞 p16 和cyclinD1 的表达及其临床意义，肿瘤防治研究J，2003，30（5）
