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1、免疫组化的基本原理,概 述 免疫组织化学（简称免疫组化）是组织化学的 一种，它是利用已知的特异性抗体或抗原能特异性结 合的特点，通过化学反应使标记于结合后的特异性抗 体上的显示剂，如酶、金属离子、同位素等，显示一 定的颜色，并借助显微镜观察其颜色的变化，从而在 抗原抗体结合部位确定组织、细胞结构的化学成份或 化学性质。,免疫组化是免疫学与组织化学相结合的一个新学科。它有三个基本要素： 免疫反应系统 示踪系统，示踪剂如辣根过氧化酶，碱性磷酸酶。 显示系统，显示剂 如3，3 二氨基联苯胺（DAB)， 3-胺基-9-乙基卡巴（AEC） 由于它是以免疫学的抗原抗体反应为理论基础，所以首先必须了解与其有
2、关的免疫学理论。,免疫反应系统,抗原的概念,抗原是一类在合适条件下能 激发机体免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物质（抗体）在体内和体外发生特异性结合反应的物质，如蛋白质，糖。物质所具有的这种特性称为抗原性.(即免疫原性和免疫反应性),抗体的概念,抗体是B细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的一类能与相应抗原发生反应的球蛋白。主要存在于血清中，也见于体液和外分泌液中。,抗原与抗体的结合是高度特异性的结合，这种结合是非常牢固的。,抗原抗体结合后，其复和物是不可见的。为了使得反应复合物可见，必须将抗体加以标记，并利用标记物同其他物质的反应将阳性结果转换成可见的发光或 显色。多年来，免疫
3、组化工作者 经过不断探索，使得免疫组化的示踪系统和显色系统不断改进。,示踪系统,1941年COONS等用荧光素标记抗体，检测肺炎双球菌在肺组织内的分布，开创了免疫荧光化学的新篇章。,免疫荧光细胞化学,免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。,该技术的主要优点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。荧光衰减，标本不易久存，且需价格昂贵的荧光显微镜,随着电子显微镜的广泛应用，1968年，日本学者中根一惠等用酶代替荧光素标记
4、抗体，开辟了免疫酶化学之路。,免疫酶细胞化学,分直接法和间接法。直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测细胞内特定抗原物质。间接法所用的第一抗体是对组织细胞内多种抗原的特异性抗体，第二抗体则为酶标记的第一抗体的抗体。所以只要不同的第一抗体均来自同一种属，同一种酶标记的第二抗体就能用来显示其不同特异性抗体的存在，这样就避免了直接法中标记每种第一抗体的麻烦，并且提高方法的敏感度。,一、直接法 原理：HRP标记在特异性抗体 （一抗）上，即形成 “ 抗原-抗体 HRP复合物”,直接法原理示意图,步骤：一步完成 特点：方法简便、省时，专一 性强，非特异染色轻， 但敏感性差，一
5、种标记 抗体只能检测一种抗原。,二、间接法 原理：HRP标记在第二抗体上， 抗原-特异性抗体-第 二抗体 HRP复合物 步骤：二步法,间接法原理示意图,特点：敏感性较直接法高，一 种标记抗体能用于相应 动物制备的多种特异性 抗体，检测多种抗原。 但较直接法费时，非特 异染色稍重。,酶标抗体技术也还存在一些问题，最主要的是酶与抗体连接可损害二者的活性。20 世纪70年代初，发展了非标记抗体酶法，包括酶桥法 ，PAP法。,三、酶桥法,酶桥法的基本原理是，首先用酶免疫动物，制备效价高，特异性强的抗酶抗体，然后利用第二抗体做桥，将抗酶抗体连接到与组织抗原结合的第一抗体上。再将酶结合在抗酶抗体上，经显色
6、显示抗原的分布。,酶桥法,特点,优点：提高了敏感性 缺点：游离的酶难以精确的稀释到所需浓度。非特异性结合的酶也难以洗去，背景色重。,四、PAP法,PAP为(peroxidase antiperoxidase)的缩写。其原理与酶桥法相似，都是借助桥抗体将酶连接在与组织抗原结合的第一抗体上，所不同的是PAP法是将游离酶和抗酶抗体在使用前先 制成酶-抗酶抗体复合物（PAP复合物），在染色过程中将酶桥法的步骤3，4合并为一，用PAP复合物代替，即用第二抗体作桥，将PAP复合物连接 在与组织抗原结合的第一抗体上。,PAP法,特点,此法解决了酶与抗体的比例难以确定的问题，PAP复合物中的抗酶抗体必须与第一
7、抗体为同种动物所产生。第二抗体必须过量，以保证更好结合。,五、APAAP法,碱性磷酸酶（AP）抗碱性磷酸酶抗体复合物的简称，用AP取代P（过氧化物酶）而成，原理与PAP相似。 优点：避开了DAB，且显色对比好,本世纪70年代以后随着免疫组化的广泛应用，技术方法不断改进，亲和组织化学引入免疫组化，形成抗生物素-生物素免疫组化染色系统。,基本原理,很早以前人们就注意到给鸡饲以大量鸡蛋白，会引起鸡的维生素H缺乏症，这是 什么原因呢？经研究发现，在鸡蛋白中有一种卵白素（Avidin)卵白素有四个同维生素（Biotin)又名生物素结合的位点，给鸡饲以鸡蛋白引起鸡的维生素缺乏就是由于卵白素和维生素大量结合
8、所致。 维生素和 卵白素之间有很强的亲和力，这种亲和力比抗原抗体之间的亲和力还要高出100万倍，能够彼此牢固结合 而不影响彼此的生物学活性。同时卵白素和维生素都具有和示踪物质如辣根过氧化物酶等结合的能力。这种反应既不是化学反应又不是免疫学反应，人们称之为亲和组织化学。,五、ABC法,1981年，上海的许世明博士在上述亲和组织化学的基础上，改良推出了亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术（avidin biotin-peroxidase complex technique，简称ABC法)。其特点是利用抗生物素分别连接生物素标记的二抗和生物素标记的酶。先制备ABC复合物（ABC复合物是将过氧化酶结合
9、在生物素上，再将生物素过氧化酶连接物与过量的抗生素蛋白反应而制备的）。生物素标记的第二抗体和ABC复合物因生物素-抗生素反应而相连接，最后进行显色定位。,Avidin（卵白素、亲和素、抗生物素）为一种碱性糖蛋白，由四个相同亚基组成 Biotin（生物素）小分子维生素 Avidin和Biotin具有较高亲和力,酶素化BiotinAvidin - ABC复合物 抗原-特异抗体- Biotin标记第二抗体- Avidin Biotin HRP 复合物：composition,组织抗原,第一抗体,第二抗体,HRP,生物素,卵白素,ABC法,ABC法原理示意图,步骤：三步法 特点：敏感性较高，特异性强，
10、 应用范围广, 某些脏器存在内源性生物素 干扰 Avidin与核酸及细胞膜中磷脂 有非特异反应,S-P法,免疫组化工作者们于20世纪90年代初以ABC法的基本原理为基础，以链酶亲和素（streptavidin,SA）代替亲和素，创建了S-P法。与亲和素相比，链酶亲和素是一种更接近完美的生物素结合蛋白。它的等电点为中性，故不易与组织的内源性生物素结合。而S-P法由于应用了链酶亲和素，其特异性更高。,S-P法原理示意图,二步法,1995年一种二步法检测系统（EnVision）的问世标志着二步法技术的诞生，其原理是用高分子葡聚糖作为载体将多个二抗分子和酶结合在一起，代替传统方法之中的二抗和三抗，使得
11、检测变得异常简单。同时祛除了因使用生物素而引起的内源性生物素所造成的背景染色。,二步法原理示意图,第一步,EnVisionTM方法（二步法）,在辣根过氧化物酶（HRP）显色 过程中，过氧化氢是特异性底物，3，3二氨基联苯胺（DAB）是供氢体。HRP在分解过氧化氢的过程中，与过氧化氢形成复合物，再与电子供体形成聚合体，在酶反应部位形成不溶性棕褐色沉淀。,显示系统,直接法,谢谢！,附加知识,DAB(Diaminobenzidine)，二氨基联苯胺是辣根过氧化物酶最敏感、最常用的显色底物，反应产物因不溶于水、二甲苯和醇的棕色沉淀物而被广泛地用于蛋白印迹（Western Blot,WB)、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)和免疫细胞化学(Immunocytochemistry,ICC)、斑点印迹(Dot blot)和生物芯片(Biochip)等的染色和显色反应。 注意事项 1 DAB溶液应低温密封保存。如有结晶析出，应确保结晶完全溶解再行使用； 2 显色工作液应现用现配，新鲜配制的工作液应为无色或浅棕色，如颜色过深，请勿使用； 3 DAB在常温下不稳定，每次取用后均应及时加盖密封放回冰箱，以免因DAB分解影响实验，或因渗漏造成实验环境污染； 4 DAB有潜在致突变作用，操作时应注意穿戴好防护用具。,
