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1、图2-1 尼康E-600 显微镜,人肉眼分辨力测试是规定在明视距离25cm所分辨的最短间距来表示，正常人肉眼分辨力的极限值是0.1mm(毫米)，显微镜的分辨力可按下列公式来计算 R=0.61/N.A （R 是分辨距离，0.61是常数， 是照明光波波长，NA是显微镜物镜的镜口率光学性能指标，每个物镜上都标有其镜口率的数值）。,分辨距离R与镜口率NA 成反比， 若把最大镜口率1.25（即油镜镜口率）代入公式，可以最小分辨距离/2由于可见光中最短波长（紫光）为0.4um（即400nm）。 普通光镜最大分辨力的理论极限为0.2um ,请记住0.2um，这个数值就是显微镜水平与亚（超）微水平的分界线。,
2、显微镜的分辨力是有一定的极限， 其放大率受分辨力制约而不可能无限提高，普通光镜放大率的经验界值：有效放大倍数极限=物镜镜口率1000。 例普通显微镜的油镜镜口率为1.25,故此台显微镜的最大有效放大倍数为1250倍。 高级研究显微镜油镜镜口率为1.4，则此镜的最大有效放大倍数为1400倍。,如果放大倍数超过限度，则视野中物象变模糊，细微结构反倒分辨不清，成为了无效放大，由于物镜镜口率受入射镜口角和介质折射率的限制，不可能更大提高，所以科学家们从两个途径来改进显微镜： 、换用短波长的照明光源提高分辨力，如紫外光显微镜，电子显微镜； 应用特殊光学效应增强反差，提高分辨能力。,图2-1尼康E-600
3、 显微镜,2、相差显微镜（phase contrast microscope） 用于没有染色的活细胞 原理：光波的三个光学特性（1）光波有波长，对于光波波长变化，肉眼觉察为颜色变化（2）光波有振幅，对于光波振幅变化（即振幅差）肉眼觉察为明暗变化（3）光波有相位（相位是指某一时刻光在其前进路线上的位置）对于光相位的变化（即相位差），肉眼不能觉察。,图2-8 相差显微镜照明原理,当光线穿过无色透明且非匀质的被检物体（例如活细胞）其波长和振幅都无明显变化，仅光相位出现了一定程度变化，此时观察感觉反差小，物体内部结构难分辨，这就是普通光镜不适宜用于观察活细胞的原因，相差显微镜却是运用一些特殊装置，使通
4、过被检物体的光线分离成两组光波，并人为地使这两组光波之间微弱的相位差加大，再经过光波干涉作用，使看不见的相位差转变成可见的振幅差，从而反差增强，使能够清晰看到被检物体及其内部细微结构，所以相差显微镜下的样品不需染色，可清晰观察活细胞及其内部结构的变化。 特点：相差显微镜有正反差和负反差两种类型，正反差（暗反差）观察效果是被检物质比周围背景略暗，物体外围显现一圈亮的光晕，而负反差（明反差）的效果则是相反。,图2-9 一种介壳虫的染色体（PCM 照片）,3、荧光显微镜 （ fluorescence microscope） 原理：以紫外光为光源，使被检材料中的荧光物质激发出荧光，从而对细胞内某些物质
5、进行定性和定位分析，荧光现象有两种： （1）自发荧光细胞内某些天然荧光物质被紫外光照射所激发的荧光，例如叶绿素血红色自发荧光。 （2）诱发荧光在细胞中加入某种不会使细胞化学组分变性的荧光染料（荧光素），与细胞内某种特定成分结合在一起，经紫外光照射激发出荧光。 例：荧光染料吖啶橙，可使RNA 发出红色荧光，而使DNA发出绿色荧光。,图2-2尼康E800 荧光DIC 显微镜,图2-3落射式照明原理,图2-4 荧光显微镜照片（微管呈绿色、 微丝红色、核蓝色）,特点：与普通光镜在结构上不同之处是： （1）采用紫外光发生装置，高压灯+激发装置+滤光装置。 （2）透镜由石英玻璃制成，以便减少道路上的紫外光
6、损耗。 （3）目镜中装压紫滤片（保护眼睛）。,荧光显微镜目前在分子细胞生物学研究中应用十分广泛，以荧光素标记各种探针进行基因定位分析和对某些特异蛋白质进行定性定位检测分析，灵敏清晰，在荧光显微镜下对样品可同时采用两种以上（有的多达612种）荧光探针检测，依据其不同颜色的荧光信号，我们能一次判断识别多个基因位点，因此这是非常实用的研究技术，此外，由于在荧光标记检测实验中，易发生一些非检测目标出现假象的“背景噪音”问题，因而现可在荧光显微镜设备上安装一套“数字成像处理系统CCD”，即把图像信息通过摄像机和电脑的图象数字化处理，使信号反差可以放大增强，对假象削弱or削除从而明显提高检测的精确率和灵敏
7、度。,4. 倒置显微镜： 是将相差显微镜的构件颠倒装配，本末倒置而成的，并装有恒温设备，闭路电视和缩时摄像机，是完善的细胞培养和观察监视系统（光源在上，目镜在下）、（培养皿，瓶中活细胞生长生活情况）。,图2-11 莱卡倒置显微镜,5.微分干涉显微镜: 是另一种不需染色而直接观察活细胞中精细结构及动态变化的技术设备，其分辨力比普通光镜提高一个数量级。,图2-10 DIC 显微镜下的硅藻（伪彩色）,6.激光共焦点显微镜: 激光共焦点显微镜的物镜和聚光镜是聚集同一焦点能排除平面以外荧光干扰，所以其分辨率比普通荧光显微镜提高1.41.7倍，还可以“光学切片”方式观察较厚样品的内部结构。,图2-5 激光
8、共聚焦扫描显微镜,图2-6 LCSM 照片，蓝色为细胞核，绿色为微管,（二）电子显微镜 1、透射电镜（transmission electron microscope,TEM） 透射电镜的放大原理与光镜基本类似，只不过是以电子枪所发射的高速电子流代替了照明光源，又以三组电磁线圈所构成的磁透镜代替了玻璃制成的聚光镜、物镜和目镜。 第一组磁透镜能将电子流聚焦到样品上（故称为会聚镜）；第二组磁透镜能使穿透过样品的电子射线折射形成初级放大像（称为物镜）；而第三组磁透镜则是通过第一第二中间镜和投影镜进行连续三次的再放大，最终投射到荧光屏上，使电子图象转变成了可见的光学图象。,图2-18 光学显微镜、TE
9、M、SEM 成像原理比较,图2-12 JEM-1011 透射电子显微镜,图2-13 莱卡超薄切片机,图2-14 内质网透射电镜图（伪彩色）,特点： （1）照明光源不同； （2）放大倍数的调节方式不同，是依靠改变磁透镜的微磁电流强度来调节放大倍数的，也就是说，电流强度的变化引起了磁场强度的改变，而磁场强度的变化又使电子射线的折射程度发生改变，因而放大倍数即随之出现变化； （3）有高压稳压系统，电子流的发射速度及波长皆取决于电压的高低。 通常透射电镜的电压达几万十几万伏的高压；,（4）有高度真空的工作系统。因为高速运动的电子流如果与空气中的微粒和分子碰撞就会改变它的发射方向，导致成像模糊，故要求电
10、镜内的工作系统（包括样品室）都必须保持高度真空状态，并且样品都必须脱水（真空中水易蒸发or升华，电子流与水分子相碰，改变其方向，使成像模糊）因此说透镜电镜不能用来观察活的样品； （5）样品厚度必须900（即90nm,0.09um）这是因为电子穿透能力有限，样品过厚则成像不清晰，并且高速穿透的电子会产生热量，将原样品烧出白斑，所以透镜电镜观察的样品须超薄切片（400500）不能用普通电镜下的组织切片（27um）；,（6）标本染色技术不同，电镜标本染色并不像光镜标本染色上各种颜色，而是使观察的结构与背景之间，黑白对比分明，反差强。所以电镜标本染色剂大多是重金属盐类。染色方法有正染、负染两类，正染常
11、采用醋酸铀或柠檬酸铅染色，使得被观察的结构较暗，背景较亮；负染则是使用磷钨酸染色，使得背景较暗，而观察的结构显得明亮突出； （7）特殊的投影技术（真空喷镀法）是对电镜标本的表面处理技术，即以真空喷镀仪在真空条件下，将金、铂等金属微粒倾斜地喷向标本，使其朝向发射原的表面沉积的金属微粒多于背面，因而电镜观察时感觉反差极强，具立体感。,图2-15 肌动蛋白纤维的负染电镜照片,（8）冰冻蚀刻（或冰冻断裂）技术freeze etching or freeze-fracture 是研究细胞各种膜相结构的处理方法，先将样品放入-190低温下迅速冰冻，再在真空中用冷却刀切割断裂，随后上升温度，让冰在真空中升华
12、成水汽跑掉，断裂面的细微结构暴露出来，再用真空喷镀仪在断面上喷一层碳膜或铂碳膜（称为“表面复型膜”）然后拿出真空之外，用有机溶剂将样品溶解掉，置“表面复型膜”于铜网上，即可上电镜观察了，因此，电镜下看到的实际上已不是样品本身，而是样品某一断裂面的“人工复制品”，这是因为人为的这种表面变型膜能比生物样品本身有更强的电子反差性能，能够以富有立体感的浮雕形式精细地反映出某一断裂的细微结构。对于“冰冻蚀刻处理的生物膜各个面，国际上统一（规定命名称为PS”代表面向细胞质基质的表面）。,图2-16 冰冻蚀刻电镜照片,2、扫描电镜（scanning electron microscope SEM）： 工作原
13、则不同于透射电镜，是以电子束在样品表面扫描，用闪烁器收集样品表面散射回来的二次电子信号，再经放大，最后在荧光屏上显示图像。 特点：不需要经过复杂处理，即可观察标本的原始外表面。,图2-17 JEOL 扫描电子显微镜,优点： （1）可观察较大，较厚的样品 （2）景深大（景深聚焦后能清晰看到物象的前后距离范围），所以图像是十分逼真的三维立体形象 （3）其放大倍数是从2020万倍的连续变倍，不须重复多次对焦，故对观察研究很方便 （4）样品可在样品室内做多方位的水平移动和转动，便于从各个角度来观察样品的全貌。 缺点： （1）分辨力不太高，仅310nm （2）不能观察样品内部。,图2-18 光学显微镜、
14、TEM、SEM 成像原理比较,图2-19 人类血细胞SEM 照片,（三）扫描隧道显微镜（scanning tunnelling microscope STM） 特殊显微镜，不是电镜，是新型探测样品外表的纳米级微观形貌的高级仪器，具有三维立体扫描物体表面的原子尺度高分辨能力，并能在常规大气or液体条件下观测样品，无须强求真空环境，也不采用高能电子流攻击样品，故有利于观察样品的真实自然形态，这是目前开展纳米结构生物学研究的重要技术，已用于直接观察DNA分子，蛋白质分子及生物微精细结构。,扫描隧道显微镜原理,二、细胞生化分析 （一）组织化学和细胞化学染色法（histochemical and cyt
15、ochemical staining methods） 利用某种显色剂能与某种细胞成分特异性结合，显示特定颜色的原理对组织和细胞内某些成分进行定位和定性分析的研究方法，可对无机盐蛋白质，醛基、碳水化合物、脂类、核酸和酶类等多种成分检测鉴定。,例：孚尔根反应（Feulgen）: 特定显示DNA的细胞化学技术，其原理是经稀盐酸水解打开DNA上嘌呤碱与脱氧核糖之间的连接链，暴露出羟基，由于羟基还原作用与无色品红（希夫试剂）结合形成紫红色的化合物，据此可对细胞内的DNA进行定性和定位检测，此外，由于染色的深度与DNA浓度是成正比关系，所以当孚尔根法染色后，再用显微分光光度计测量，即可对细胞内的 DNA
16、含量进行定量测定。 再例： comori法显示酸性磷（pi）酸酶（溶酶体标志酶）,（二）免疫细胞化学: （immunocytochemistry）依据抗体能与对应的抗原自行相互识别结合的免疫学原理来检测特定蛋白质在细胞内的分布状况，首先将某种抗体联结上标记物（光镜观察用的标记物是荧光素or 酶，而电镜观察用的标记物是胶体金），再与组织or 细胞样品混合反应，随后在光镜or 电镜下检查标记物沉积的部位，即对抗原进行定位测定，如果标记物是荧光素时，则是在荧光显微镜下检查荧光信号部位，以显示抗原存在位置。,抗体与抗原结合的方式分直接法和间接法 两种: (1)直接法是先将抗体与荧光素结合，然后将样品用荧光素标记的抗血清浸染，使荧光抗体与抗原结合反应后，再在荧光显微镜下鉴别抗原的存在部位。 (2)而间接法的不同之处是在抗原抗体初级的基础上，再增加一种能同初级抗体发生结合反应的次级抗体（即“抗抗体”），从而使初级反应得到“放大”，以增强分析观察的灵敏性和准确性。,如果与抗体联结的标记物是酶，则可采用与酶的底物反应，产
