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1、ICS67.060B21DB37山东省地方标准DB 37/T 31042018向日葵杂交种品种纯度SSR分子检测标准The variety purity identification technique of sunflower seeds with SSR2018 - 02 - 02发布2018 - 03 - 02实施山东省质量技术监督局发布DB37/T 31042018前言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省农业厅提出。本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位:山东农业大学、北京德农种业有限公司。本标准起草人：张春庆、赵洪春、郑建鹏、温大兴、
2、李岩。本标准为首次发布。10向日葵杂交种品种纯度SSR分子检测标准1 范围本规程规定了SSR分子检测向日葵种子纯度的试剂配比、DNA提取、SSR引物选择、多重PCR方法、PCR产物检测等技术要求。本规程适用于向日葵品种和杂交种种子纯度的室内快速鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 3543 种子检验技术规程GB 20464 农作物种子标签通则3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1杂交种各种直接用于生产的杂交向日葵一代种子。3.2品种纯度
3、品种在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示。3.3标准样品能够充分代表种或品种特征特性的种子样品，或具备指定特征、特性样品。3.4引物一条互补结合在模板DNA链上的短单链，能提供3-OH末端作为DNA合成的起始点，延伸合成模板DNA的互补链。4 原理从向日葵种子中提取DNA，利用SSR引物进行PCR扩增，不同碱基长度的PCR扩增引物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并通过染色显示DNA指纹谱带类型。不同向日葵品种由于遗传组成不同，基因组中DNA简单重复序列的重复次数有差异，这种差异可通过PCR扩增、电泳、染色程序获得的DNA指纹图谱加以区分，从而对不同品种进
4、行鉴定。杂交种纯度鉴定时，可从附表中选取亲本有差异的SSR引物。品种纯度鉴定时，从附表中选择生产上常用品种间有差异的引物。5 仪器与试剂5.1 仪器电子天平，水平摇床，双垂直板电泳槽，PCR仪，电泳仪，高压灭菌锅，观片灯。5.2 试剂丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、谷氨酸、乙二胺四乙酸二钠、硼酸、过硫酸铵、四甲基乙二胺（TEMED）、氢氧化钠、氢氧化钾、甲醛、2 Power Taq PCR Master Mix、超纯水、SSR引物、硝酸银（所用试剂均为分析纯，所用水均为去离子水)。6 溶液6.1 提取液称取0.56 g氢氧化钾于100 mL烧杯中，加去离子水溶解并定容至100 mL，4 贮存备用。6
5、.2 30% 凝胶溶液称取292 g丙烯酰胺于1000 mL烧杯中，加去离子水溶解，再加入8 g甲叉双丙烯酰胺，溶解后定容至1000 mL，4 贮存备用。6.3 5TBE称取54 gTris、3.72 g乙二胺四乙酸二钠、27.5 g硼酸于1000 mL烧杯中，溶解后定容至1000mL。6.4 催化剂称取10 g过硫酸胺于100 mL烧杯中，加去离子水溶解并定容至100 mL，4 贮存备用。6.5 电极缓冲液取5TBE 200 mL，用去离子水定容至1000 mL。6.6 染色液称取1 g硝酸银溶于500 mL去离子水中。6.7 显色液称取10 g氢氧化钠溶于500 mL去离子水中，用时加2
6、mL甲醛。7 操作程序7.1 DNA提取从送验样品中随机数取向日葵种子200 粒，将种子剥壳后纵切，放入1.5 mL离心管中，加入300 L提取液，提取时间1 min24 h均可，使用前混匀、静止5 分钟、离心3000 rpm，0.5 min，取上清即为DNA样品，用于PCR扩增时DNA样品模板量为2 L。7.2 扩增体系采用20 L扩增体系，其中每对U-primers的上下游引物(10 M )各0.5 L，2 L25mmol/L MgCl2 ，0.2 L5U/L Taq酶，2 L10 PCR Buffer，2 L DNA提取液，用灭菌后的超纯水补足20 L。7.3 多重PCR扩增程序通用多重
7、PCR扩增程序采用“两段循环模式”：a) 预变性(94 ，5 min)；b) 第一段循环(循环数：3)命名为“逐一退火循环”：变性(94 ，40 s)；按照未加通用接头前的多对引物的退火温度从高到低的顺序逐一退火，每个退火温度的退火时间为20 s；延伸(72 ，30 s)；c) 第二段循环(循环数：2832，通常为30个循环)：变性(94 ，40 s)；将退火和延伸过程合并(70 ，50 s)；d) 终延伸(72 ，10 min)。引物选择参考附表，每个杂交种选择35对亲本有差异的引物扩增。7.4 扩增产物检测可用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，也可用高通量检测设备，对PCR产物进行检测。聚丙烯酰胺凝
8、胶电泳检测程序如下。7.4.1 凝胶制备将洗净晾干的玻璃板采用水平平板灌胶的方式组装玻璃板，用铁夹固定，取20 mL 5TBE，30 mL 30 %Acr，50 mL去离子水于烧杯中，加800 uL1000 uL的10 % APS，80 uL100 uL TEMED 混匀，灌入板中，插入梳子，10 min左右聚合，拔出梳子，吸取多余的水，装板。7.4.2 点样用微量移液器取2 ul体系加入样品槽，每加一个样品后，清洗移液器两次，区分不同引物加marker。7.4.3 电泳加样完毕后，加入电极缓冲液，上槽电极缓冲液要没过矮玻璃板，下槽电极缓冲液要没过玻璃板，将电源线正极接下槽，负极接上槽。接通电
9、源，180 V稳压电泳2.5 h。7.4.4 卸板、染色、显色倒出电极液，卸开电泳槽并用油灰刀取出胶片，将胶放入去离子水中水平摇床1 min，倒掉去离子水，加入染色液硝酸银，水平摇床2 min3 min，倒掉，加入去离子，水水平摇床1 min，倒掉，加入显色液500 ml（2 %氢氧化钠，用时加入甲醛2 ml），水平摇床至显色为止，倒掉显色液，加入去离子水水平摇床1 min。7.4.5 谱带分析待整个供检样品电泳结束后，鉴定凝胶胶片上电泳谱带的一致性。对检测的SSR引物双亲谱带同时出现的为本品种，只有某一亲本谱带为亲本，谱带与双亲位置有差异的籽粒为杂粒。8 结果计算计数供检样品粒数（N）和非本
10、品种粒数（M），并按式计算电泳测定值X%（保留一位小数）。X（%）=（N - M）/ N1009 结果报告按照GB/T 3543，写明对照样品名称，使用的亲本有差异的引物数量，检测粒数，纯度%。对送样样品的检验需注明：“结果仅对样品负责”；监督检验时，需注明：“结果对种子批负责”。AA附录A （规范性附录）引物及其参数表A.1规定了标准中引物及其参数。表A.1 引物及其参数引物名称序列(5to3)Tm退火温度ORS928-FCATGGTTATTTTGGTTTGGGTTT54.8 54ORS928-RGCTATTATCATGTCCTTGTCCTTTT57.1 ORS613-FGTAAACCCTA
11、GGTCAATTTGCAG58.4 55(+2、+1)ORS613-RATCTCCGGAAAACATTCTCG55.8 ORS543-FCCAAGTTTCAGTTACAATCCATGA56.8 56ORS543-RGGTCATTAGGAGTTTGGGATCA58.2 ORS694-FCCTGGAACTGAACCGAGAAC59.8 59(-1、+1、+2)ORS694-RGCCGTGAAACAGAGAGAGGA59.8 ORS956-FGGACCAGATTGCTTCCTAGACTT60.2 54ORS956-RTCAACATGCGTGATTATTGTTTG54.8 ORS483-FCCGAAC
12、AACAATCTCCACAA55.8 55ORS483-RGGTTTAGGTGTCGCATCACA57.8 ORS925-FATGATTCTAAGTTGCGGTAGTGC58.4 57ORS925-RGTTGGGTTTAAGTTGTTGCTTCC58.4 ORS1025-FGACATGGCTTGAACATTTGATTA54.8 54ORS1025-RTCTTATATGCACATCAGTACAAGTCTC59.0 ORS1021-FAACCCTAATCCAACCAGATACGA58.4 57ORS1021-RTACCACCAGCTCATCCTTAACCT60.2 ORS1079-FTACGACT
13、GACGATTCCATTTCTC58.4 57ORS1079-RAACTGGATTTCACAGGGAGTGTT58.4 ORS1256-FGATGTTGATGTTGGTGAAGTTGC58.4 57ORS1256-RCTCCGTCACCTTAAGCACTTGTA60.2 ORS409-FTCCCAGACTAGAGATCGACCA60.0 57ORS409-RAAACTCAAGGGACTAAGGTTGC58.2 ORS1108-FACCACACTTATCCAAAGGTTTAAGG58.7 58（-1）ORS1108-RCGTGAGAGTAGTTACGAGAAGGAGA62.0 表A.1 引物及其
14、参数 (续)引物名称序列(5to3)Tm退火温度ORS727-FGGTGGCAAGTGGTGGTTAGA59.8 57ORS727-RAAAGCTGGTCATCTCAAGGGTA58.2 ORS801-FCCATCTTGGACGCACATCTA57.8 57ORS801-RGAACCACCCGATCATATCCA57.8 ORS366-FAACCAACTGAGCATTCTTGTGA56.3 55ORS366-RGCGCTAGGTTAAAGAGGACAAA58.2 ORS331-FTGAAGAAGGGTTGTTGATTACAAG56.8 55ORS331-RGCATTGGGTTCACCATTTCT55.8 ORS1065-FACCGCTGTCAACACCTTAAACTC60.2 59（-1）ORS1065-RGGCTGGGAATCAACTGCTACTAC62.0 ORS885-FAATGTAAGCCAGAATCCCAAATG56.6 56ORS885-RCCTTCGTCGTTTCCAAGTAGATT58.4 ORS1088-FACTATCGAACCTCCCTCCAAAC60.1
