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1、吕自力简介,女，汉族，硕士导师，副教授 19911996年广西医科大学临床专业学士 19961999年广西医科大学病理专业硕士 2003-2006年中山医科大学病理专业博士 1999-至今工作于广西医科大学 QQ 489506642 电话：15907817634， 5356534（办公室）,病理学常用技术在科研中的应用,广西医科大学第一附属医院病理科 吕自力,尸体剖检 autopsy,gold standard 活体组织检查 biopsy,frozen sections. 细胞学检查 cytology,（一）人体病理学的诊断和研究方法:ABC,（二）实验病理学的研究方法,动物实验 animal
2、 experiment 组织和细胞培养 tissue & cell culture,病理学的研究方法,病理学的形态观察方法和新技术,大体观察 组织学和细胞学观察 组织化学和细胞化学 免疫组织化学 超微结构 分子生物学技术 流式细胞术 计算机图象分析技术,qualitative,quantitative,病理学的应用范围,病因学研究 发病学的研究 基本病理变化揭示疾病的本质、进行病变诊断、分类、分期以及预后判断 药物选择与疗效观察 新药开发,内 容,免疫病理学技术,常规HE染色及特殊染色,分子病理学技术,一、HE染色在科研中的运用,1、HE染色的用途,1）组织结构特点,2）细胞形态特点,2、HE
3、染色流程,固定 取材 脱水,包埋 切片 染色 观察,3、HE染色注意事项,1）标本采集,组织尽可能多 尽量获取未坏死组织 尽量避免挤压组织 标记标本的方位,3、HE染色注意事项,2）固定,A.及时固定（离体30分钟内） B.固定液：10%的中性福尔马林固定； C.骨髓活检、睾丸活检标本也可用Bouin液固定 D.电镜标本用2.5%戊二醛固定 E.固定液与标本体积比应大于10：1 F.固定时间：2-4小时（小），12-24小时（大）,二、特殊染色在科研中的应用,1、目的 1）识别病原体：HP, 抗酸，PAS,特殊染色的用途,2）识别组织：Masson, VG, PAS,三、免疫组织化学 Immu
4、nohistochemistry, IHC,原 理 使用范围 试剂配置 操作步骤,免疫组织化学的原理,抗原 + 抗体 - 显色,原位,半定量,蛋白,用途,临床病理诊断：肿瘤分类诊断 上皮来源：CK，EMA 间叶来源：Vimentin 淋巴组织: LCA 科研：组织抗原表达情况,试剂准备,切片(防脱片),多聚赖氨酸, APES,一抗,多抗or单抗,兔or鼠, 注意种属特异性，针对检测组织种属,检测试剂盒,EliVisionTM plus 检测试剂盒（二步法） SP试剂盒（三步法） SABC试剂盒（三步法）,显色试剂盒,DAB试剂盒,其他,H2O2，二甲苯，酒精，缓冲液（PBS，柠檬酸缓冲液），抗
5、原修复液（胰酶），正常动物非免疫血清,操作步骤,组织切片脱蜡，水化,PBS洗3次 X 3分钟,抗原修复,一抗 （37度1h，4度过夜）,封闭内源性过氧化物酶,PBS洗3次 X 3分钟,二抗 （37度30分钟）,PBS洗3次 X 3分钟,苏木素染核,自来水洗,DAB显色,脱水,封片,PBS洗3次 X 3分钟,结果分析和判断,阴性,CK胞浆阳性,细胞核阳性-PCNA,胞膜阳性,注意事项,（1）判断原则 （2）对照设计 （3）非特异染色 （4）失败的原因及其处置方法,（1）判断原则,必须设立染色对照：阴性对照，阳性对照 抗原表达必须在特定部位：胞膜、核、浆 尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞
6、的阳性表达 对免疫组化标记结果的意义不能绝对化,（2）对照设计,阳性对照：已知阳性表达的组织 自身对照：同一标本中不同组织对照 阴性对照： A、阴性组织对照：已知阴性表达的组织 B、阴性试剂对照：空白对照,（3）非特异性染色,原因,组织内源性成分的干扰： 内源性过氧化物酶-白细胞，红细胞 内源性生物素-肝、胰、肾组织,组织处理不当： 内源性过氧化物酶-白细胞，红细胞 内源性生物素-肝、胰、肾组织,（3）非特异性染色,处理方法,抗体：纯化，浓度，时间，温度,封闭：H2O2， 非免疫动物血清,清洗：充分,显色：时间,其他：脱蜡充分，无干片,（4）染色失败的原因及处理方法,试验片：- 阳性对照片：-
7、 阴性对照片：- 空白对照片：-,结果：假阴性,原因： 操作步骤？ 试剂？,试验片：+ 阳性对照片：+ 阴性对照片：+ 空白对照片：+,结果：假阳性,原因： 切片干涸 抗体浓度过高 缓冲液配制不对 冲洗不彻底 显色液配制不对 显色时间过长 载玻片的粘合剂过厚,试验片：+ 阳性对照片：+ 阴性对照片：- 空白对照片：+,结果：假阳性,原因： 非特异染色，与二抗交叉反应。,试验片：+ 阳性对照片：+ 阴性对照片：+ 空白对照片：-,结果：可疑阳性,原因： 阴性对照组织选择不准确，含有靶抗原,试验片：+ 阳性对照片：+ 阴性对照片：- 空白对照片：-,结果：阳性,原因： 方法可靠，实验片含靶抗原。,
8、阴性对照切片-，阳性对照标本和待检测切片呈弱阳性,原因： 标本固定不当 抗体试剂问题：浓度、效价低 抗原修复不当 显色时间短,切片染色深或整张切片出现染色,抗体浓度过高 切片显色时间过长 组织没有正确封闭 冲洗不够充分,切片出现非特异性背景染色,内源性过氧化物酶、内源性生物素过多 血清封闭时间过短 抗体不纯 组织片内出血或坏死成分 冲洗不彻底,四、免疫荧光技术,将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对 抗原进行细胞定位,免疫荧光技术,五、分子生物学技术原位杂交,分子生物学技术 原位杂交和原位PCR,HPV DNA & CK,组织芯片,病理学技术,杂交,
