2013免疫学与临床诊断基础课件

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1、1,免疫学与临床诊断基础,管宝全 北京热景生物,2,2,目 录,免疫学基本概念 抗原抗体结合反应的特点及影响因素 免疫学在临床诊断上的基本应用,3,3,1、免疫学基本概念,免疫 抗原 抗体,4,免疫（Immunity）,机体识别“自我”与“非自我”的过程。 通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能。 人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。,免除瘟疫,5,免疫的功能,抵抗感染（Defense）：机体能抵抗病原微生物侵袭的能力，又称免疫防御。 当该功能过于亢进，发生超敏

2、反应；当该功能过于低下，发生免疫缺陷病。 （抗菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫免疫） 自身稳定（Homeostasis）：清除机体在新陈代谢过程中产生的大量衰老死亡细胞，维持机体的生理平衡。该功能异常时，发生自身免疫病。 免疫监视（Immunological surveillance）：识别、清除因物理、化学和病毒等生物因素的影响而发生癌变的机体细胞。当这一功能低下或失调时，会导致肿瘤或癌症。,6,7,抗原,抗原：凡能刺激机体产生特异性抗体和致敏淋巴细胞，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外发生反应的物质。 构成抗原的条件 1. 异物性：只有外源性的物质才具有免疫原性，产生免疫反应。 亲缘关系

3、越远，差异越大，抗原性越强 自身抗原：自身组织发生异常变异、免疫功能紊乱，眼球晶体蛋白、精子蛋白、甲状腺蛋白 大分子性：一般在10 kD以上，分子量越大，抗原性越强 。 3. 具有复杂的立体结构或空间构象. 如明胶分子量虽然为100 kD，但结构简单，免疫原性差,8,抗原的特性,免疫原性：抗原能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞的性能，即诱导免疫应答的能力 抗原性：抗原与特异性抗体或致敏淋巴细胞发生反应的性能，也称反应原性 完全抗原与半抗原 具备免疫原性和反应原性两种能力的物质称为完全抗原，如病原体、异种动物血清等。 只具有反应原性而没有免疫原性的物质，称为半抗原，如青霉素、磺胺等。半抗原没有免疫

4、原性，不会引起免疫反应。但在某些特殊情况下，如果半抗原和大分子蛋白质结合以后，就获得了免疫原性而变成完全抗原，也就可以刺激免疫系统产生抗体和效应细胞。,9,抗原决定簇（表位）,一般抗原决定簇是由612氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。 大多存在于抗原物质的表面，有些存在于抗原物质的内部，须经酶或其他方式处理后才暴露出来 线性或连续决定簇；构象或不连续决定簇 抗原决定簇（B细胞）；免疫原性决定簇（T细胞） 功能性决定簇；隐藏性决定簇,抗原决定簇：抗原分子表面具有免疫活性的化学基团,是抗原与抗体结合的部位，决定抗原特异性。,10,抗原决定

5、簇是免疫应答和免疫反应具有特异性的物质基础,抗原以抗原决定簇与相应淋巴细胞的抗原受体结合而激活淋巴细胞引起免疫应答。即淋巴细胞表面的抗原识别受体通过识别抗原决定簇而区分“自身”与“异己”。 抗原也是以抗原决定簇与相应抗体特异性结合而发生反应的。,11,抗体,抗原刺激B淋巴细胞, 使之增殖分化成浆细胞而产生的能与抗原发生特异性反应的免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig) 主要分布在血清中，也分布于组织液及外分泌液中。,12,免疫球蛋白,免疫球蛋白：在人和动物血液、组织液及其他分泌液中的一类结构相似的球蛋白。 1964年，世界卫生组织举行专门会议，将具有抗体活性以及与抗体相关的球蛋白统

6、称为免疫球蛋白（Ig）。,13,抗体的功能,免疫球蛋白的功能 与抗原结合 激活补体 组织结合 调理作用 抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC） 免疫球蛋白的双重性 免疫球蛋白是一种蛋白质，是抗体( Ab1 )； 同时又可引起机体产生抗体（抗抗体,Ab2 ），所以既是抗体又是抗原,14,抗体与抗原结合,抗体的主要功能是与抗原（包括外来的和自身的）相结合，从而有效地清除侵入机体内的微生物、寄生虫等异物。 每种抗体与特定的抗原决定基结合。 这种结合可以使抗原失活，也可能无效但有时也会对机体造成病理性损害，如自身抗体的产生，对人体可造成危害。,15,抗体与补体结合,（1）增强吞噬作用，增强吞噬细胞的

7、趋化性； （2）增加血管的通透性； （3）中和病毒； （4）细胞溶解作用； （5）免疫反应的调节作用等。,补体可辅助和补充特异性抗体，介导免疫溶菌、溶血作用,16,抗体的制备,抗血清：指抗原人工免疫实验动物，获得含特异性抗体的血清。 多克隆抗体 (PAb)：多个抗原决定簇免疫机体所产生的多种抗体的混合物。 单克隆抗体（MAb） ：只针对某一特定的抗原决定簇，纯度高的抗体。,17,17,2、抗原-抗体反应的特点,反应原理 三大特点 影响因素,18,抗原抗体反应原理,抗原的抗原决定簇与抗体的结合部位之间的结构具有互补性，二者相互结合后，在适宜条件下，可出现可见反应。因此，抗原抗体反应是指抗原与相对

8、应的抗体之间所发生的特异性结合的反应。 反应可分为两个阶段，第一阶段为抗原与抗体发生特异性结合的反应阶段，此阶段反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可见反应。第二阶段为可见反应阶段，即抗原抗体复合物在环境因素（如电解质、pH、温度、补体等）的影响下，表现为凝集、沉淀、补体结合等肉眼可见的反应。此阶段反应慢，常需数分钟、数小时或甚至数日。,19,抗原抗体反应的特点1：高度特异性,高度特异性指一种抗原只能与由它刺激所产生的抗体结合的专一性。它是免疫学诊断的重要基础。 亲和力(affinity)：抗体分子上一个抗原结合部位与相应抗原决定簇之间的结合强度。 亲合力(avidity): 一个抗体分子与整个

9、抗原之间的结合强度。 抗原抗体的结合实质上是抗原决定簇与抗体超变区之间的结合，由于两者在化学结构和构型上呈互补关系，所以结合具有高度特异性。 由于抗原成分复杂，常含有多种抗原决定簇，如果两种不同抗原分子上有相同的抗原决定簇或抗原、抗体之间构型部分相同皆可出现交叉反应。,20,特异性,抗原A,抗原C,抗原B,特异性反应,交叉反应,无反应,21,抗原抗体反应的特点2：可逆性,在一定条件下抗原抗体复合物这一反应是可逆的。抗原抗体复合物解离的程度与两者的亲和力有关。 亲和力与抗体结合价相关，是抗体功能结合力 抗原抗体之间的结合主要是分子表面的非共价键结合，稳定，但在适当条件（如低pH、高浓度盐、冻融等

10、）下可解离开，各自的生物学特性不发生改变。根据此特点，可利用亲合层析法纯化抗原或抗体。,22,可逆性,K（亲和常数）=,Ag+Ab,Ag Ab,23,抗原抗体反应的特点3：浓度比率适宜性,抗原、抗体比例适合时，在适宜的盐浓度下可形成肉眼可见的反应物（凝集物或沉淀物）。 在沉淀反应和凝集反应中抗原或抗体极度过剩则无沉淀物形成，只有在抗原抗体只有在最适比例时才出现肉眼可见的沉淀物。 网络学说大多数抗体是两价的，而抗原是多价的。当抗原与抗体处于等价带时，可互相结成为具有立体结构的巨大网络状聚合体，形成肉眼可见的沉淀物。但当抗原或抗体过量时，由于结合价不能相互饱和就只能形成较小的沉淀物或可溶性抗原抗体

11、复合物。,24,适合比例性,抗体含量,抗原含量,前带,后带,等价带,以定量抗原检测抗体，若抗体过剩，可使所形成的免疫复合物反而减少，而不出现凝集。,以定量抗体检测抗原，若抗原过剩，可使所形成的免疫复合物反而减少，而不出现凝集。,25,抗原抗体反应的影响因素,温度：适当的温度可增加抗原与抗体分子碰撞的机会， 加快二者结合速度。不宜过高过低。 电解质：可使IC复合物失去电荷而凝聚，出现可见反应。常用生理盐水稀释抗原或抗体。而抗原抗体发生特异性结合后，虽由亲水胶体变为疏水胶体，若溶液中无电解质参加，仍不出现可见反应。 酸碱度：最适pH68，否则可出现假阴或假阳性结果 抗原和抗体性质：抗体的特异性和亲

12、和力是关键，初次应答抗体亲和力低，单克隆抗体亲和力低；抗原理化性质、抗原表位多寡等。,26,26,3、免疫学在临床诊断上的基本应用,概论 分类 趋势,27,免疫学诊断概论,免疫学诊断：用免疫学检测技术确定疾病相关因子、监测疾病过程、判断疗效及预后，涉及对疾病相关因子的诊断和辅助诊断，以及检测机体免疫功能状态。 应用范围 疾病诊断：感染性疾病、免疫缺陷病、自身免疫病、超敏反应性疾病、肿瘤 免疫监测：辅助诊断、疗效判断、病情分析、预后判断,28,免疫学检测的分析学表现,准确性 精密度 灵敏度 特异性,检测线性范围 试剂稳定性 定标周期 开瓶效期,29,免疫学检测的分析学表现,临床灵敏度和特异性是分

13、析结果准确性的临床表现:,理想状态,健康人群,疾病人群,灵敏度 100% 特异性 60%,特异性 100% 灵敏度 50%,灵敏度增加 特异性增加,假阴性 假阳性 Cut-off,设置cutoff值在此处 用于筛查分析,设置cutoff值在此处 减少错误诊断带来的高花费,设置cutoff值在此处 为了最少化错误结果,30,免疫学检测技术分类,根据抗原的性质、出现结果的现象、参与反应的成分不同，可将检测抗原抗体反应分为： 凝集反应 沉淀反应 补体结合反应 标记免疫反应,31,凝集反应（agglutination),细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后，在适宜电解质下形成肉眼可见凝集物的反应。

14、 直接凝集：玻片和试管凝集 间接凝集： 正相间接凝集和反向间接凝集 间接凝集抑制试验：,32,33,沉淀反应（precipitation),血清蛋白质、细菌裂解液或组织浸液等可溶性抗原与相应抗体结合后，在有电解质存在时，出现肉眼可见的沉淀物的反应。,34,1 单向免疫扩散 (single immunodiffusion) （1）特点：定性定量试验。以数值计算为基础的单向辐射状免疫扩散试验。常用于抗原定量。 （2）用途：可用于测定血清IgG,IgM,IgA和C3等的含量 （3）原理：沉淀环的直径与抗原含量呈正相关。 （4）操作：铺板 = 打孔=加样=放湿盒 =看结果。,35,36,2 双向免疫扩

15、散(double immunodiffusion) （1）特点：定性半定量。分析鉴定抗原、抗体纯度和抗原特异性的试验。即抗原和抗体分子在凝胶板上扩散，二者相遇并达到最适比例时形成沉淀线。 （2）用途：用于抗原或抗体的定性检测、组成和多抗原相关性分析。 （3）操作：铺板=打孔 =加样=放湿盒 =看结果。 3 对流免疫电泳试验 其实质是将双扩与电泳相结合，又叫反向免疫电泳或免疫电渗电泳。 （1）特点：定性试验。将琼脂内电泳和凝胶内沉淀反应相结合。比琼脂扩散法的灵敏度要高1016倍，而且反应时间短，可用于各种蛋白的定性和半定量测定。 （2）用途：主要用于病原微生物抗原的定性检测。 （3）操作：铺板=

16、打孔 =加样 =电泳 =看结果。,37,38,4 免疫电泳 （immunoelectrophoresis) 也是将电泳技术与双向免疫扩散结合的一种技术，先电泳后双向免疫扩散 。,39,5 免疫比浊 （immunoephelometry） 在一定量抗体中分别加入递增量的抗原，经一定时间形成IC，液体浑浊，用浊度计测反应体系的浊度，据标准曲线推算样品中抗原含量。,40,补体结合反应,可溶性抗原，如蛋白质、多糖、类脂质和病毒等，与相应抗体结合后，抗原抗体复合物可以结合补体，但这一反应肉眼不能察觉，如再加入红细胞和溶血素，即可根据是否出现溶血反应来判定反应系统中是否存在相应的抗原或抗体。这个反应就是补体结合反应。 补体存在于哺乳动物血清中，各种动物比较，豚鼠血清中补体含量最高，成分较全，效价稳定，采取方便，故通常将豚鼠的全血清作为补体。补体结合反应中的抗体主