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1、2019/4/24,1,外源基因在原核表达体系中的表达,王欣 生物化学系,2019/4/24,2,前言,在分离到某一基因后，要对其编码蛋白质进行研究，最理所当然的工作就是表达 即：有目的地合成外源基因产物。 基因表达技术是基因工程的核心。至今，人们已建立了许多基因表达系统，既有原核生物基因表达系统，也有真核生物基因表达系统。它们各有其特点，包括优势和不足。由于人们对不同系统的研究深度很不一样，这就决定了它们的成熟程度和应用范围。,2019/4/24,3,如何以大肠杆菌质粒DNA为载体克隆一个编码动物激素的基因，并使之在大肠杆菌中进行表达？简要说明实验中可能遇到的问题及可能的解决办法。,2019
2、/4/24,4,2019/4/24,5,现代生物技术发展史上的重要事件 年 代 事 件 1917 Karl Ereky 首次使用“生物技术”这一名词 1943 大规模生产青霉素 1944 Avery, Macleod 和Mccarty 通过实验证明DNA是遗传物质 1953 Watson 和Crick 阐明了DNA的双螺旋结构 1961 生物技术和生物工程杂志创刊 19611966 破译遗传密码 1970 分离出第一个限制性内切酶 1971 Khorana等人合成了完整的tRNA基因 1973 Boyer和 Cohan建立了DNA重组技术 1975 Kohler和Milstein 建立了单克隆
3、抗体技术 1976 第一个DNA重组技术规则问世（Struhl,Vapnek,Chang et al） 1977 DNA测序技术诞生 1978 Genentech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素 1980 Guarante等在科学杂志上发表以质粒、乳糖操纵子为基础建立起来的大肠杆菌表达系统，这一发明构成了大 肠杆 菌表达系统的雏形。 美国最高法院对Diamond和 Chakrabarty专利案作出裁定，认为经基因工程操作的微生物可获得专利 1981 第一台商业化生产的DNA自动测序仪诞生 第一个单克隆抗体诊断试剂盒在美国被批准 1982 用DNA重组技术生产的第一个动物疫苗在欧洲获得批准 1983
4、 基因工程Ti质粒用于植物转化 1988 美国授予对肿瘤敏感的基因工程鼠以专利 PCR方法问世 1990 美国批准第一个体细胞基因治疗方案 1997 美国科学家培养出第一只克隆绵羊多莉 1998 美国批准爱滋病疫苗可以进行人体实验 日本科学家培养出克隆牛，英美等国培养出克隆鼠 2000 英国科学家培养出转基因克隆猪 2001 人类基因组筐架图公布 2002 水稻基因组筐架图公布 小鼠基因组筐架图公布 2003 中国科学家研制的重组腺病毒-p53注射液获得国家食品药物监督管理局首次批准的新药证书，成为世界上第一个获得 正式批准的基因治疗药物 2004 英国当局（Human Fertilisati
5、on and Embryology Authority, HFEA）首次批准英国一科研单位进行人类细胞核移植治疗 性克隆研究 2005 人类基因组“差异图”公布 10月27日,全球科学家通过分析全球不同人群之间的遗传基因信息,初步绘制出首张人类DNA序列中变异基因片段的遗 传图谱。该研究结果不但会进一步改变人们对生物学和人类进化的理解,而且将帮助科研人员更方便地找出与人类主 要疾病(如哮喘、糖尿病、心脏病和癌症)密切相关的变异基因,从而改进对这些疾病的预防、诊断和治疗技术。 (Nature, 2005，437: 1299) 2006 Piwi-干扰RNA 2007 在涉及胚胎干细胞和DNA重组
6、方面的一系列突破性发现,2019/4/24,6,基因工程技术,是将一种生物细胞的基因分离出来，在体外进行酶切和连接并插入载体分子构成遗传物质的新组合，引入另一种宿主细胞后使目的基因得以复制和表达的技术。其特点是打破物种界限，赋予生物新的遗传性；目的是使外源基因在受体细胞内按人们期望的方式进行表达。,让任何一种生物接 受另一种生物的遗传物质 并在其细胞内表达 功能和稳定遗传,在试管内直接 操作遗传物质改变 基因功能,调节基因 表达方式,2019/4/24,7,基因工程的主要研究内容,1 获得具有遗传信息的目的基因 2 选择基因载体获得重组DNA 3 将重组DNA分子导入宿主细胞 4 鉴定带有目的
7、基因的克隆；目的基因的扩增及获得目的产物,2019/4/24,8,基因工程药物 指利用基因工程技术研制和生产的药物，主要包括重组蛋白多肽药物、反义核酸药物、DNA药物、 siRNA药物和基因工程抗体等。,2019/4/24,9,基因工程制药的特点,和传统制药业相比，基因工程制药有如下突出优点。 可以获得天然来源难以得到的生理活性物质，使之成为新药。 利用基因工程技术使得活性蛋白、多肽基因可以在微生物、真核 细胞乃至动物反应器、植物反应器中获得高效表达，使生理活性蛋白多肽可以批量生产，保障临床治疗需要。 提供足够数量的生理活性物质以对其结构、功能、性质进行深入研究，从而进一步扩大这些活性物质的使
8、用范围。 通过基因工程技术可以不断发掘和开发更多的新型生理活性物质。 利用基因工程、蛋白工程技术可以改造内源生理活性物质，进一步提高其生物活性。 采用基因工程技术可以获得新型化合物，扩大药物来源。,2019/4/24,10,研究重组表达技术的目的及意义,研究蛋白质的作用机理和功能； 是研究蛋白质的一大基础技术，当生化提取方法难以获得足量的蛋白质时； 重组技术使蛋白质结构变化，获得各类异构体。,2019/4/24,11,原核表达体系,大肠杆菌表达系统 Escherichia coli 枯草杆菌表达系统 Bacillus anthracis 芽孢杆菌表达系统 Bacillus 链霉菌表达系统 St
9、reptomyces,2019/4/24,12,各表达系统的使用率（PubMed),2019/4/24,13,大肠杆菌表达体系 Escherichia coli 内容提要,原核表达的基本知识 提高外源基因表达水平的措施 介绍几种表达载体 外源基因在大肠杆菌中表达的进展,2019/4/24,14,大肠杆菌质粒,一类独立于染色体外自主复制的双链、闭环DNA分子； 结合转移型 非结合转移型,不在宿主间转移,整合到染色体上的频率低, 具有遗传学上的稳定性和安全性.,?,2019/4/24,15,理想的大肠杆菌表达载体必须具备的基本条件,稳定的遗传复制、传代能力 抗菌素抗性基因（显性的转化筛选标记） 适
10、用于外源基因插入的酶切位点或具有若干限制酶单一识别位的点 较小的分子量和较高的拷贝数 启动子的转录是可以调控的，抑制时本底转录水平较低 启动子转录的mRNA能够在适当的位置终止，转录过程不影响表达载体的复制,2019/4/24,16,表达载体的基本元件,复制子 筛选标记 启动子 终止子 核糖体结合位点 复制子：是一段包含复制起始点、反式因子作用区在内的DNA片段，其功能是通过复制使质粒能稳定存在于大肠杆菌内。,在同一大肠杆菌细胞内，同一复制子类型的不 同质粒不能存在于同一细胞中，不同复制子类型的不同 质粒可以存在于同一细胞中，这就是 同种不相容、异种相容现象。,?,2019/4/24,17,表
11、达载体,将克隆的真核基因置于大肠杆菌的转录转译信号控制之下。这种按特殊设计构建的，能使克隆在其中特定位点的外源基因的编码序列，在大肠杆菌中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体。 它分为表达型质粒载体和表达型噬菌体载体。 可控转录启动子 转录调控序列。,2019/4/24,18,基因表达,系指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有 加工过程。 外源基因在原细胞中的表达,系指令克隆的外源基因 在原核细胞中以发酵的方式 快速、高效地合成基因产物,2019/4/24,19,用 途 克隆化基因导入大肠杆菌用于大量表达蛋白质方法,以融合蛋白的形式制备抗真核蛋白的多克隆或单克隆抗体 大量产生完整的天然蛋白质
12、分子以研究其结构和功能 产生由病毒癌基因和细胞癌基因所编码的蛋白质，微注射到体外培养的哺乳动物细胞中，以表明其生物学活性 PULL-DOWN实验，研究蛋白质与蛋白质的相互作用,2019/4/24,20,在编码目的蛋白的基因中引入突变并在细菌中大量生产蛋白突变体的方法，为蛋白质工程的研究奠定基础 生产具有医用价值的人体蛋白等,2019/4/24,21,原核生物与真核生物基因表达的比较,2019/4/24,22,原核生基因表达的特点,只有一种RNA聚合酶(真核细胞有三种)，识别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。 表达是以操纵子为单位的。 原核生物由于无核膜,所以转录与翻译是耦联的，二者是连续
13、进行的。特点是当mRNA还在生长中时，即还在被DNA转录的时候，它就开始翻译了。,2019/4/24,23,原核生基因表达的特点,不含内含子(intron)，原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。因此外源基因要以cDNA克隆于载体上。 其基因的表达控制主要是在转录水平。 大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，有一保守顺序即AGGAGGU，叫SD(Shine-Dalgarno)顺序。与核糖体小亚基上的16SrRNA3末端序列互补。,2019/4/24,24,真核基因组的特点,基因组存在于细胞核内，一般是线状DNA。 存在大量的重复序列和很多不编码的序列。 基因中常有内含子，功能上相关的基因集中程
14、度总的来讲不如原核生物。,2019/4/24,25,原核细胞表达真核基因的障碍,缺乏真核细胞转录后的加工系统，成熟的mRNA不能形成。 缺乏真核细胞翻译后的加工系统。,2019/4/24,26,外源基因在原核细胞中 表达的重要调控元件,启动子 在转录过程中，首先与RNA聚合酶结合并准确有效地起始转录的特异DNA序列叫做启动子。 -50bp + 起始点 + 立即下游少数碱基。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所应用的启动必须是原核启动子，将外源基因克隆在其下游，原核RNA聚合酶识别原核启动子，并带动真核基因在原核细胞中转录。与启动子强度有关的结构要素有：-35区顺序、-10区顺序、两者的间隔。,2019/4/24,27,原核系统中通常使用的可调控 的强启动子有如下几种,1. Lac启动子 操纵子: 在原核生物中，共同完成某一生理功能的一些基因，编成一个结构 基因簇即构成一个操纵子。Lac启动子来自大肠杆菌的乳糖操纵子。 2. LacUV 是大肠杆菌经紫外诱变，而产生的一个突变的乳糖启动子对分解代谢抑制不 敏感，即使在没有CAP-cAMP的情况下，转录也
