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1、12 型腺相关病毒重组绿色荧光蛋白转染体外培养神经干细胞的实验研究【摘要】 目的 探讨 2型重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus 2, rAAV-2）载体能否有效地转染 NSCs。方法 采用含有增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）报告基因的 rAAV-2（rAAV-2/EGFP） ，以感染复数（multiplicity of infection, MOI）分别为1104、1105、1106 转染体外分离、培养的大鼠胎鼠 NSCs，在荧光显微镜下观察 EGFP的表达；同时检测子代细胞
2、的活力、增殖倍数、分化情况来评估对其存活、增殖、分化能力的影响；当 EGFP表达稳定后，流式细胞仪检测 rAAV-2/EGFP对 NSCs的转染效率。结果 转染 10天后各转染组便可观察到 NSCs克隆球发出绿色荧光，起始荧光强度不一，随 MOI值的增大而增强；各转染组荧光强度随时间的延长而逐渐增强，至转染 21天后达高峰并维持，此时流式细胞仪检测 rAAV-2对 NSCs的转染效率：MOI 为 1104、1105、1106 时转染率分别为 25.68%、50.60%、54.72%, 荧光指数（FI）分别为 4.08、12.72、14.06；转染组和未转染组细胞培养 7、14、21 天时其细胞
3、活力、增殖倍数、分化差异均无显著性。结论 rAAV-2 能有效地转染 NSCs，所介导的目的基因能高效表达。 【关键词】 神经干细胞；2 型腺相关病毒；转染；感染复数；绿色荧光蛋白；荧光指数；细胞活力【Abstract】 Objective To investigate the transfection efficiency of recombinant adeno-associated virus 2 （rAAV-2） in cultured neural stem cells.Methods The neural stem cells of rat embryo cultured, ind
4、entified in vitro was infected with the rAAV-2 expressing the enhanced green fluorescent protein（EGFP） gene by different multiplicity of infection（MOI=0,1104,1105,1106 ）. After transfection, the expression of EGFP was detected by fluorescent microscope. At the same time, the cytotoxicity of rAAV-2 t
5、o NSCs was evaluated by cell proliferation, cell vitality and cell differentiation. The tranfection efficiency was evaluated by flow cytometer.Results EGFP was initially expressed in the neural stem cells-drived neurosphere of all transfected groups 10d following infected by rAAV-2/EGFP.The level of
6、 expression increased with the increase of MOI, subsequently gradually increased and reached peak on 21d.Transfection efficiency and fluorescent index （FI） were 25.68%, 4.08 （MOI=1104）; 50.60%, 12.72 （MOI=1105）; 56.72%, 14.06 （MOI=1106） respectively. During the period of the culture, cell proliferat
7、ion, cell vitality and cell differentiation in the transfected and untransfected group had no difference.Conclusions The rAAV-2 can transfect neural stem cells efficiently, and the rAAV-mediated transfer of the gene can be expressed in the NSCs.2【Key words】 neural stem cells；recombinant associated a
8、deno virus 2; transfection; multiplicity of infection; green fluorescent protein; fluorescent index；cell vitality绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因是一种新的报告基因，由于其表达产物 GFP可被直接激发产生荧光，不需要任何底物或辅助因子，较传统的标记基因如 2-半乳糖苷酶基因、荧光素酶基因等更具有明显的优越性；在 GFP的基础上进行 F64L和 S65T的突变从而形成增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent
9、protein，EGFP） ，EGFP 增强了 GFP的荧光性能，更容易观察、检测1 。2 型腺相关病毒具有与人类疾病无相关性、宿主范围广、可整合入细胞染色体 DNA介导外源基因长期表达等优点,是较理想的基因载体2 。随着神经干细胞（neural stem cells，NSCs）的分离、培养、纯化及生物学功能研究深入35 ，寻找 NSCs基因修饰载体及标记分子，已成为研究NSCs在体内、外分化调控和细胞工程基因治疗中枢系统疾病的研究热点。运用基因修饰神经干细胞治疗中枢系统疾病具有细胞修复和转基因治疗的双重优势。理想的基因转移载体是基因修饰的关键。1 材料与方法1.1 病毒载体 rAAV-2/E
10、GFP 购于 863生物领域病毒基因载体研究开发基地、北京本元正阳基因技术股份有限公司，滴度为 51011v.g/ml。1.2 神经干细胞分离、培养、鉴定6 按参考文献进行，体外分离胚胎大鼠大脑额叶皮质、悬浮培养，经 Nestine鉴定为神经干细胞（见图 1） ，作为实验细胞株。1.3 主要试剂、仪器 DMEM/F12培养液、胎牛血清（HyClone 公司产品） ；表皮生长因子（EGF） 、碱性成纤维生长因子（bFGF） （SIGMA 公司产品） ；兔抗巢蛋白 Nestin抗体、罗丹明标记山羊抗兔二抗（北京中杉金桥公司产品） 。相差倒置显微镜（Cannon） 、倒置荧光显微镜（Nikon） 、
11、细胞计数板、CO2 培养箱、超净台、流式细胞仪（BD） 。1.4 rAAV-2/EGFP体外转染神经干细胞1.4.1 分组 取生长良好的 NSCs，机械反复轻柔吹打分散、200 目不锈钢筛网过滤制备成单细胞悬液，以 1105个细胞/孔接种于 4块 6孔培养板中，分别按感染复数（MOI） （v.g/cell）=0、1104、1105、1106 转染，设四组，其中 MOI=0作为未转染对照组。1.4.2 转染 转染时先按 MOI值计算所需加入 rAAV-2/EGFP病毒载体的体积数，在试管中将所需加入 rAAV-2/EGFP病毒载体与 DMEM/F12培养液混合形成转染液，将每组对应孔中加入相应的
12、 2ml转染液，MOI=0 作为未转染对照组，同样操作但不转染 rAAV-2/EGFP，37，5%CO2 培养箱培养 2h后，1000r/min 离心35min，如此 DMEM/F12清洗细胞 2次，弃病毒残液，补充完全细胞培养液（DMEM/F12 加 2%B27，20ng/ml 的 EGF、bFGF）5ml，37，5%CO2 培养箱培养，常规换液、传代。在倒置荧光显微镜下观察、记录 rAAV-2/EGFP转染 NSCs后EGFP的表达情况。1.5 rAAV-2/EGFP体外转染对神经干细胞存活、增殖、分化的影响 rAAV-2/EGFP转染 NSCs后，各组分别在 7、14、21 天细胞传代时
13、台盼兰拒染法检测细胞活力、细胞计数计算增殖倍数。0.2%台盼兰溶液与细胞悬液混匀，死细胞着色，而活细胞不着色，计数活细胞数及死细胞数。细胞活力为活细胞数/（活细胞数死细胞数） 。EGFP 表达稳定时，10胎牛血清诱导各组 NSCs克隆球分化，观察分化情况。1.6 流式细胞仪检测基因转染率和表达效率7 rAAV-2/EGFP转染 NSCs后，各组在各相应的时间点细胞机械反复轻柔吹打分散、200 目不锈钢筛网过滤制成单细胞悬液，上流式细胞仪（BD） ，以未转染组为对照，激发光为 488nm、吸收光为 530nm，进行数据获取与分析；分析结果用转染率和荧光指数（fluorescent index，F
14、I）表示。转染率即 EGFP阳性细胞的阳性率，荧光指数主要反映了目的基因的表达效率。每一样品收集 1104个细胞，根据细胞大小设定一个单细胞区域，该区域的细胞用于荧光分析。以未转染组的细胞作为阴性对照，设定 GFP阳性细胞区（M1 区）使阴性对照 M1区细胞数不超过 0.1%，流式细胞仪分析结果用转染率和荧光指数 FI表示。转染率即为 GFP阳性细胞阳性率，FI 主要反映了目的基因的表达效率，分别用下列公式计算：转染率=样品 M1 区细胞百分率 阴性对照 M1区细胞百分率；FI=样品 M1区细胞百分率样品M1 区平均荧光强度 阴性对照 M1区细胞百分率阴性对照 M1区平均荧光强度。在上述两个公
15、式中，减数很小，一般情况下可忽略不计。1.7 统计学处理 各组数据均用 xs表示，组间比较用单因素方差分析，实验数据用统计软件 SPSS11.0进行统计学处理。2 结果2.1 rAAV-2介导的 EGFP基因在 NSCs中的表达 rAAV-2/EGFP转染NSCs，10 天后 EGFP开始表达，倒置荧光显微镜下可见各转染组神经球受蓝色光激发产生的呈团块状的绿色荧光，但较弱且强度不一，总体上感染复数越大荧光越强；随后表达显著增加，21 天时达高峰，这时荧光较强（见图 2） ，表明细胞球中多数细胞被转染并成功表达 EGFP，细胞继续传代培养，仍可见大量荧光。22 rAAV-2对神经干细胞活力、增殖
16、、分化的影响 不同 MOI的 rAAV-2转染组和未转染对照组的 NSCs在倒置显微镜下观察，均生长良好，细胞透光性好，形态完整，细胞碎片少，NSCs 形成克隆球速度相当，细胞稳定性好，可连续传代，各组细胞在 7、14、21 天台盼兰拒染法检测细胞活力差异均无显著性（P0.05） （见表 1） 。同时各组细胞在 7，14，21 天细胞计数从而计算增殖倍4数，转染组与未转染对照组在相应时间点差异亦无显著性（P0.05） ，并在培养过程中呈指数生长趋势（见表 2） 。 表 1 rAAV-2转染对 NSCs活力的影响注：均为同一时间点转染组和未转染组对照比较，组间比较 P0.05，差异无显著性表2 rAAV-2转染对 NSCs增殖倍数的影响注: 均为同一时间点转染组和未转染对照组比较，组间比较 P0.05，差异无显著性。EGFP表达稳定时，10胎牛血清诱导各组分化后，各组均可见神经干细胞克隆球在含 10%胎牛血清的 DMEM/F12培养基中 6h左右细胞克隆球贴壁，12h
