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1、第二十二章 免疫学检测技术的基本原理,教 学 要 求: 1 掌握凝集反应、沉淀反应的定义及其基本类型。 2 掌握间接免疫荧光法和ELISA的双抗夹心法及间接法的基本操作步骤。 3 熟悉检测体液免疫和细胞免疫的常用试验方法。 4 了解免疫学检测方法的应用。,免疫学诊断即用免疫学检测技术确定疾病相关因子、监测疾病过程、判断疗效及预后，涉及对疾病相关因子的诊断和辅助诊断，以及检测机体免疫功能状态。 第一节 体外抗原抗体结合反应的特点及其影响因素 抗原抗体反应原理：抗原的抗原决定基与抗体的结合部位之间的结构应具有互补性，二者相互结合后，在适宜条件下，可出现可见反应。,免疫学诊断,一、抗原抗体反应的特点
2、 （一）高度特异性 指一种抗原只能与由它刺激所产生的抗体结合的专一性。它是免疫学诊断的重要基础。 1 亲和力(affinity)：抗体分子上一个抗原结合部位与相应的抗原决定基之间的结合强度。 2 亲合力(avidity): 一个抗体分子与整个抗原之间的结合强度。 3 抗血清： 4 一抗： 5 二抗：,（二）适宜的抗原抗体浓度和比例： 抗原、抗体比例适合时，在适宜的盐浓度下可形成肉眼可见的反应物（凝集物或沉淀物）。 （三）抗原抗体反应的可逆性： 抗原抗体之间的结合主要是分子表面的非共价键结合，稳定，但在适当条件（如低pH、高浓度盐、冻融等）下可解离开，各自的生物学特性不发生改变。根据此特点，可利
3、用亲合层析法纯化抗原或抗体。,（四）抗原抗体反应分两个阶段 二、抗原抗体反应的影响因素： 1 温度：适当的温度可增加抗原与抗体分子碰撞的机会， 加快二者结合速度。不宜过高过低。 2 电解质：可使IC复合物失去电荷而凝聚，出现可见反应。常用生理盐水稀释抗原或抗体。,3 酸碱度：最适pH68，否则可出现假阴或假阳性结果 4 抗原和抗体性质：抗体的特异性和亲和力是关键，初次应答抗体亲和力低，单克隆抗体亲和力低；抗原理化性质、抗原表位多寡等。,第二节 检测抗原和抗体的体外试验,根据抗原的性质、出现结果的现象、参与反应的成分不同，可将检测抗原抗体反应分为下列几类： （一）凝集反应（agglutinati
4、on) 细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后，在适宜电解质下形成肉眼可见凝集物的反应。,1. 直接凝集：玻片和试管凝集 2 间接凝集： 正相间接凝集和反向间接凝集。 补充介绍： 3. 协同凝集：以SPA为载体的反向间接凝集。在微生物检测中常用。 4. 间接凝集抑制试验：,抗原或抗体的检测方法,（二）沉淀反应（precipitation)： 血清蛋白质、细菌裂解液或组织浸液等可溶性抗原与相应抗体结合后，在有电解质存在时，出现肉眼可见的沉淀物的反应。 1 单向免疫扩散 (single immunodiffusion) （1）特点：定性定量试验 （2）用途：可用于测定血清IgG,IgM,IgA和
5、C3等的含量 （3）原理：沉淀环的直径与抗原含量呈正相关。 （4）操作：铺板 打孔 加样 放湿盒 看结果。,2 双向免疫扩散(double immunodiffusion) （1）特点：定性半定量 （2）用途：用于抗原或抗体的定性检测、组成和多抗原相 关性分析。 （3）操作：铺板 打孔 加样 放湿盒 看结果 。,3 对流免疫电泳试验 （补充介绍） 其实质是将双扩与电泳相结合。 （1）特点：定性试验 （2）用途：主要用于病原微生物抗原的定性检测。 （3）操作：铺板 打孔 加样 电泳 看结果 。,4 免疫电泳 （immunoelectrophoresis) 也是将电泳技术与双向免疫扩散结合的一种技
6、术，先电泳后双向免疫扩散（见图） 。,5 免疫比浊 （immunoephelometry） 在一定量抗体中分别加入递增量的抗原，经一定时间形成IC，液体浑浊，用浊度计测反应体系的浊度，据标准曲线推算样品中抗原含量。,（三）免疫标记技术 P232 用荧光素、酶、放射性核素等标记抗原或抗体后进行抗原抗体反应。提高检测灵敏度、快速、可定性、定量，定位等。,免疫荧光标记技术,1 免疫荧光法 可对标本中的抗原进行鉴定和定位。常用的荧光素有FITC和PE，前者发黄绿色荧光，后者发红色荧光。 用途：可用于检查细菌、病毒、螺旋体等的抗原或抗体，帮助诊断传染病；也可用于鉴定免疫细胞的CD分子，检测AID的抗核抗
7、体等。,（1）直接法：缺点是每检查一种抗原必须制备相应的荧光抗体。 （2）间接法：敏感性比直接法高，制备一种荧光二抗可用于多种抗原的检查，但非特异性增多。,2. 免疫酶测定： P231 是将抗原抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合。敏感度可达1ug/L,甚至1ng/L。常用的标记物有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等。 常用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）测定可溶性抗原或抗体，用酶免疫组化法测定组织中或细胞表面的抗原。,免疫酶标记技术,（1）ELISA: 双抗体夹心法：用于检测可溶性的特异性抗原。 操作基本步
8、骤：用已知抗体包板 洗涤 封板 洗涤 加入待检标本 洗涤 加酶标抗体 洗涤 加底物显色 结果观察。,免疫酶标记技术, 间接法：检测特异性抗体。非特异性增加。 基本步骤：用已知抗原包板 加入待检 标本 加酶标二抗 加底物显色 观察结果。,P232,（2） BAS-ELISA:生物素-抗生物素蛋白系统（biotin-avidin system, BAS）, 放大系统。 （3）微粒捕获酶免疫分析技术：用于检测微量可溶性抗原。 (4) 酶免疫组化法： 对抗原进行定性、定量、定位检测。 3 放射免疫测定法： 敏感度可达pg水平。常用于检测微量物质，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、吗啡、地高辛药物和IgE等
9、。,4 免疫印迹法：P233 又称Western-blotting，用于蛋白质检测。是将凝胶电泳与固相免疫结合，把电泳分区的蛋白质转移到固相载体后，再用酶免疫、放射免疫等技术测定。常可检测多种病毒的抗原或抗体。见P234,第三节 免疫细胞的测定,淋巴细胞是机体内主要的免疫细胞，检测其数量和功能是了解机体免疫状态的重要手段。 一 淋巴细胞的分离 常用ficoll（淋巴细胞分离液）密度梯度离心除去红细胞、粒细胞而获得外周血单个核细胞（PBMC），再经吸附除去单核细胞而得到淋巴细胞。若要分离T细胞，可用尼龙毛柱、抗CD3单抗、E花结试验等分离。,二、免疫细胞细胞的鉴定 根据细胞的某些标志，采用免疫荧
10、光法、磁珠分离法、流式细胞术等方法可确定细胞不同类型和比例。 （一）T细胞功能测定 1. T细胞增殖试验 植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA）等丝裂原及抗CD3单抗等能非特异性激活培养的T细胞，使其转化成淋巴母细胞的试验。,淋巴细胞功能测定,在该增殖过程中，细胞DNA、RNA、蛋白质的合成增加，细胞形态改变。也可检测特异性抗原致敏的T细胞。 （1）氚标记的胸腺嘧啶核苷掺入法：该法灵敏、可靠，应用广泛，但需特殊仪器（液体闪烁仪），易有放射性污染。 （2）MTT法：该法操作简单，无放射性污染，但敏感性相对较差。,淋巴细胞功能测定,2 细胞毒试验： Tc、NK细胞对靶细胞有直接杀伤作用，可根
11、据待检效应细胞的性质，选用相应的靶细胞。 （1）51Cr释放法：用51Cr标记靶细胞，记数仪测定释放的51C活性。 （2）MTT法：其原理与增殖试验相同，但甲 生成量与靶细胞溶解破坏水平呈负相关。 （3）乳酸脱氢酶释放法：细胞受损致膜通透性改变，乳酸脱氢酶释放到培养液中。,3 细胞因子检测： CK的检测有助于了解其在免疫调节中的作用，鉴定分离的淋巴细胞，监测某些疾病状态的细胞免疫功能。常用的检测方法有以下三种： （1）ELISA法： （2）生物活性测定法： （3）聚合酶链反应（PCR）：,淋巴细胞功能测定,4 皮肤实验 正常机体对某种抗原产生细胞免疫后，用相同抗原做皮肤试验时出现以局部红肿为特征的DTH。细胞免疫正常时出现阳性反应，细胞免疫低下则呈阴性反应。 该方法简便，可帮助诊断某些病原微生物感染（如结核杆菌、麻风杆菌等）及免疫缺陷病等。,淋巴细胞功能测定,（二）B细胞功能测定 B细胞介导体液免疫，检查B细胞的数量与功能是确定体液免疫是否正常的重要手段。 1 B细胞增殖试验 2 抗体形成细胞的测定：吸附有特异性抗原的SRBC与抗体形成细胞分泌的Ig特异性结合后活化补体，溶解SRBC。又称溶血空斑试验。,
