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1、免疫组化的原理,张斌 天津医科大学,免疫组化原理,免疫组化的原理,免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。,原理： 组织或细胞内的某种化学物质（待检测物） 抗原 免疫动物 抗体 检测（免疫组织化学） 荧光素 酶 金、银颗粒,P-ERK：一抗：鼠来源的单克隆抗体.,链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法,三、免疫组化染色方法的类别,直接法 间接法 PAP法 ABC法 LSAB法 一步法（EPOS） 两步法（Envision）,直接法,将荧光、酶、金直接标记在一抗上进行显色，
2、没有联结系统、未用桥抗体。 优点：特异性高、非特异染色轻。 缺点：敏感性低，要求抗体浓度高。每种一抗均需用酶来标记,间接法,将标记物标记在桥联抗体上（即二抗、三抗） 一抗往往是兔身上产生的多克隆抗体，其酶标抗体必须是针对兔 优点：敏感性高，只需少数几种动物的二抗就可以和所有一抗相匹配 缺点：特异性差,PAP法 过氧化酶-抗过氧化酶法,组成： 一抗是针对靶抗原的特异性抗体 二抗是联结抗体，一面联结一抗，另一面联结PAP复合物 三抗是以过氧化物酶为抗原，在与一抗同种动物身上诱发产生的抗体，并与辣根过氧化物酶形成复合物（PAP）,PAP法 （过氧化酶-抗过氧化酶法）,优点： PAP复合物中含酶更多，
3、且是一种非标记的免疫组化方法，敏感性更高 PAP复合物常来自两种不同的动物（鼠、兔），鼠PAP用于一抗为单克隆抗体的染色，兔PAP多用于一抗为多克隆抗体的染色 可用于福尔马林固定的石蜡切片,ABC法 （亲和素-生物素法）,组成： 一抗、生物素化的二抗、ABC复合物（亲和素+酶标生物素） 优点： 亲和素和生物素有强大亲和力，使其比直接和间接酶标法更敏感，也超过PAP法。 能用于常规石蜡切片。,亲和素,生物素,酶,亲和素有四个生物素分子特异性结合部位，其结合力强，不可逆，还可和辣根过氧化酶或荧光素等结合 亲和素-生物素复合物是一个三维空间的结构，它利用亲和素为中介，一端通过生物素化的抗体联接第一抗
4、体，另一端通过生物素化酶与显色系统相连接，产生多级放大，从而提高此生物反应的敏感性和特异性 AB复合物多用于ABC法的免疫组化中,亲和素生物素复合物（ ABC ）,LSAB（SP）法 标记的链霉亲和素-生物素法,特点：将HRP直接标记于链霉亲和素上 优点： 更快速：空间结构更小 更敏感：链霉亲和素的亲和性更强，更易于到达深部位点 非特异背景更少：链霉亲和素空间结构特殊，不易与高荷电的组织成分（胶原纤维、结缔组织）联结,酶标亲和素,在AB复合物中，酶是标记在生物素上，而后与亲和素合成复合物。在标记的亲和素-生物素方法中是将辣根过氧化酶直接标记在亲和素上，辣根过氧化酶与亲和素间有极强的结合力，因此
5、LSAB法比ABC法更敏感,一步法（EPOS）及两步法（Envision）,特点 以多聚体为载体，联结了酶和一抗（一步法）或二抗的Fab段和酶（二步法） 优点 操作简便，省时 提高了敏感性和特异性 减少了背景着色 避免内源性生物素的干扰,多聚物载体,一步法及二步法载体试剂，可分别称DAKO EPOS及DAKO Envision试剂 核心是一种柔韧的多聚物，它能结合一抗和酶分子，起到载体的作用 一步法多聚物载体试剂是多聚物结合特异性一抗和辣根过氧化酶，二步法多聚物载体试剂是一种能与二抗相联结的由HRP标记的多聚物,辣根过氧化酶的免疫组化染色的反应过程: HRP + H2O2 HRPH2O2 有色
6、分子终末产物 + HRP DAB（电子供体） HRP：酶 H2O2：底物 HRPH2O2：酶底物复合物 受氢体为过氧化氢； 供氢体较多包括DAB；,抗体抗原的结合是肉眼看不见的，显色系统的目的就是使这种看不见的反应变为看得见，从而确定抗原的存在及其定位，显色系统由酶、底物加上显色剂组成，若显色剂为DAB，则出现棕褐色细颗粒沉淀,DAB(3,3-二氨基联苯胺显色液) 配法:DAB 50mg 0.1mPBS 100ml 30%H2O2 30-40ul,PBS的PH和离子强度的使用,免疫组化原理及流程介绍,建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M,中性及弱碱性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成
7、，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解。,免疫过氧化酶染色的多种方法中，其主要的不同点在于显色系统的差异： 间接酶标法：利用标记于桥联抗体的酶 PAP法： 利用PAP复合物 ABC法： 利用AB复合物 LSAB法: 利用直接标记于亲和素的酶 EPOS一步法及EnVision二步法：多聚物载体,其目的都是设法提高免疫组化染色的敏感性,显示系统,三 免疫组化的基本流程,免疫组化原理及流程介绍,1.脱蜡与水化,2. 封闭内源性过氧化物酶,3.抗原修复、暴露抗原决定簇,4.封闭非特异性蛋白,5.一抗孵育,6.二抗孵育,7.SP 反应,8.显色,9.复染、脱
8、水、透明、封片,2. 封闭内源性过氧化物酶,免疫组化原理及流程介绍,1.脱蜡与水化,脱蜡与水化的目的是确保抗体等其它试剂能够充分与组织中抗原等结合发生反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。,免疫组化原理及流程介绍,2. 封闭内源性过氧化酶,其主要目的是降低内源性过氧化物酶的活性。在传统的ABC法和SP法中，免疫组化反应结果容易受到内源性过氧化物酶的干扰，必须用过氧化氢等进行灭活。,免疫组化原理及流程介绍,3. 抗原修复 暴露抗原决定簇,由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗
9、原决定簇重新暴露，提高抗原检测率。,免疫组化原理及流程介绍,常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。,抗原修复的主要方法:,酶消化方法一般用于细胞内抗原,应用高频电磁波打开蛋白质间的交联键,免疫组化原理及流程介绍,4.封闭特异性蛋白,组织切片上有些剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性。,封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中有一些动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合。,免疫组化原理及流程介绍,5.一抗孵育,一抗:可以特异结合底物，就是识别出我们想要检测的东西。一抗和底物结合与否用肉眼是看不出来的。,一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要
10、，包括孵育时间和抗体浓度。 一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关。一般37度1-2h，或4度过夜和从冰箱拿出后常温复温45min。,免疫组化原理及流程介绍,1.防止脱片；2.使抗原抗体结合更稳定。,免疫组化原理及流程介绍,6.二抗孵育,二抗:可以和一抗结合，并带有可以被检测出的标记(如带荧光、放射性、化学发光或显色基团），作用是检测一抗。,二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索。 但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。,免疫组化原理及流程介绍,7.SP反应,SP染色法
11、即链霉素抗生物素蛋白 生物素过氧化酶连接法。 该法是ABC法基础上的进一步改良。,免疫组化原理及流程介绍,8.显色,在免疫组化中，由于抗原抗体所形成的复合物本身没有颜色，不能直接观察，只能借助于其他某些化学基团的显色作用，是复合物显色，有利于显微镜下观察。,免疫组化原理及流程介绍,9、复染、脱水、透明、封片,复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，经常用的试剂为苏木素。,片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蓝即可。,1, 盐酸酒精:使用浓度1% 36-38%盐酸：1ml 75%乙醇：99ml 2, 氨水：使用浓度为0.2%
12、25-28%:0.2ml 自来水:100ml 3，素木精染色原理 素木精为碱性天然燃料，可使核着色。细胞核内染色质的成分主要为DNA，在DNA的双螺旋结构中，两条核苷酸链上的磷酸基向外，使DNA双螺旋外侧带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的素木精碱性染料以离子键或氢键结合而被染色。素木精在碱性溶液中呈蓝色。,4，盐酸酒精的分化作用：染色后，用某些特定的溶液将组织过多结合的染色剂脱去，这个过程为分化作用。所用的溶液称为分化液。酸能破坏苏木精的醌型结构，使组织与色素分离而退色。经苏木精染色后，必须用1%的盐酸酒精分化，使细胞核过多结合的苏木精染料和细胞浆吸附的苏木精染料脱去。 5，返蓝作用：分化之后，苏木精在酸性条件下，处于红色离子状态，呈红色，在碱性条件下，处于蓝色离子状态，呈蓝色。组织切片经1%的盐酸酒精分化后呈红色或粉色，故分化之后，立即用水除去组织切片上的酸而终止分化，再用弱碱性水（0.2%氨水）使苏木精染上的细胞核呈现蓝色。,
