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1、第二章,生物大分子的纯化方法,蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题 达到足够纯度的生物大分子的制备工作作为前题 。,概 述,沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀等） 离心 吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析 快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。,常用的分离纯化方法和技术有：,沉淀法,沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。 基本原理：溶解度的不同 不同溶解度的产生的原因：亲和力的差异 溶解度的大小与下列因素有关： 溶质和溶剂的化学性质及结构 加入某些沉淀剂 溶液的pH值、离子强度和极性,中性盐沉淀法（盐析法） 有机溶剂沉淀法 蛋白
2、质沉淀法 有机聚合物沉淀 选择性沉淀法（热变性沉淀和酸碱变性沉淀） 结晶沉淀法,在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法：,中性盐沉淀（盐析法）,在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。 在蛋白质领域应用最广，其突出的优点： 成本低，不需要特别昂贵的设备。 操作简单、安全。 对许多生物活性物质具有稳定作用。,中性盐沉淀蛋白质的基本原理,盐分级沉淀：多次盐析的应用,中性盐的选择： 常用的中性盐中最重要的是(NH4)2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点： 1) 溶解度大： 几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水） 0 20 80 100 （NH4)2SO4 70
3、.6 75.4 95.3 103 Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2 NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101,2) 分离效果好 3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用 4) 价格便宜，废液不污染环境 缺点：需要一定时间脱盐,盐析的操作方法：固体法、饱和溶液法、透析法 最常用的是固体硫酸铵加入法 原则：缓慢均匀少量 在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法 各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可由附录（p24-25）中查出。,盐析曲线的制作,如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。具体操作方法如下：
4、取待分离样品溶液(已定量测定蛋白质或酶的活性与浓度)，冷至05，调至该蛋白质稳定的pH值，分610次分别加入不同量的硫酸铵,第一次加硫酸铵至蛋白质溶液刚刚开始出现沉淀时，记下所加硫酸铵的量，这是盐析曲线的起点 继续加硫酸铵至溶液微微混浊时，静止一段时间，离心得到第一个沉淀级分，然后取上清再加至混浊，离心得到第二个级分，如此连续可得到610个级分 按照每次加入硫酸铵的量，在附录中查出相应的硫酸铵饱和度。将每一级分沉淀物分别溶解在一定体积的适宜的pH缓冲液中，测定其蛋白质含量和酶活力 以每个级分的蛋白质含量和酶活力对硫酸铵饱和度作图，即可得到盐析曲线,蛋白质量(mg)或酶活力 10 20 30 4
5、0 50 60 70 80 90 100 硫铵饱和度,1) 蛋白质的浓度： 较适中的浓度0.2 % 2.0% 2) pH值对盐析的影响：pI 3) 温度的影响：离子强度 04,盐析的影响因素：主要盐析常数Ks,常用方法：凝胶过滤法和透析法 透析法：,脱盐,基本原理 降低水溶液的介电常数，使溶剂的极性减小 有机溶剂脱水作用,有机溶剂沉淀法,分辨能力比盐析法高 沉淀不用脱盐，过滤比较容易 其缺点是对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行,有机溶剂沉淀法的优点是：,有机溶剂的选择和浓度的计算 与水互溶:乙醇、甲醇和丙酮 。 进行沉淀操作时，欲使溶液达到一定的有机溶剂浓度，需要加
6、入的有机溶剂的浓度和体积可按下式计算： V = V0 (S2 S1) (100S2),温度： 一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高 样品浓度：蛋白质初浓度： 5mg/mL20mg/mL pH值：pI附近 离子强度：盐浓度5%，V2倍,有机溶剂沉淀的影响因素,仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用 碱性蛋白质、凝集素、种金属,蛋白质沉淀法,聚乙二醇 HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH(n4) (Polyethylene Glycol , PEG ) 亲水性强，溶于水和许多有机溶剂 对热稳定 有广范围的分子量 在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为400 6000 的 PEG,有机聚合物沉淀法
7、,本方法的优点： 操作条件温和，不易引起生物大分子变性 沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相当多的生物大分子 沉淀后有机聚合物容易去除,原理：利用理化性质等方面的差异 热变性 表面活性剂和有机溶剂变性 选择性酸碱变性,选择性变性沉淀法,在特定的条件下，改变溶解度产生沉淀的方法。 不等同于等电点沉淀法,结晶沉淀法：,透析,自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已有近150年。透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一 作用: 除盐 除少量有机溶剂 除去生物小分子杂质 浓缩样品,半透膜：纤维素 将半透膜制成袋状 袋内外两边的浓度达到平衡为止 “保留液” “渗出液
8、”或“透析液” MwCO,扩散压(透析的动力) 透析的速度: 膜的厚度 溶质的浓度梯度 膜的面积 温度 检查透析效果的方法是：用 BaCl2检查(NH4)2SO4，用 AgNO3 检查NaCl、KCl等,制备核酸,DNA-蛋白质(DNP) RNA-蛋白质(RNP),去污剂 有机溶剂 蛋白水解酶,DNPRNP复合物的解聚,十二烷基硫酸钠(SDS)或Tween40 乙酸钾溶液 离心除去沉淀物 上清液即为初步纯化的核酸制品,(1)去污剂,苯酚、氯仿 上层水相(含核酸)和下层有机相 界面：变性凝聚蛋白 收集水相,(2)有机溶剂,水相和有机相的位置 充分接触，速度适当 苯酚重新蒸馏 异戊醇混合液,注意点
9、 ：,溶菌酶 蛋白酶K 蛋白酶E (需灭活DNase),(3)蛋白水解酶,杂质的消除,(1)多糖 体内的糖原和淀粉自然分解 选择性沉淀剂如异丙醇、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，适用于酸性多糖),(2)DNA与RNA的分离 盐析法 DNA和RNA在NaCl溶液中溶解度不同 1-2mol/L; 0.14mol/L 酶水解法 DNase和RNase,核酸沉淀,(1)有机溶剂 乙醇-盐溶液 DNA片段1kb的核酸溶液，置室温下仅需数分钟，高速离心 异丙醇,核酸沉淀的形状与其分子质量密切相关 106Da：丝状纤维 106Da：凝胶,(2)聚乙二醇: 阶梯式浓度 1.65kb的DNA，5PEG 1.2kb的DNA，6PEG 0.6kb的DNA，7PEG (3)十六烷基三甲基溴化铵(CTAB),
