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1、第四章 灭菌、接种与培养,一、灭菌 （一）玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌：干热灭菌是利用烘箱加热到160180的温度来杀死微生物。通常采用170持续90分钟来灭菌。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为包扎。灭菌时应渐进升温，达到预定温度后记录时间。烘箱内放置的物品的数量不宜过多。到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱。,（二）不耐热的物质采用过滤灭菌：一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法。 防细菌滤膜的网孔的直径为0.45mm以下，当溶液通过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻，,（三）空间采用紫外
2、线和熏蒸灭菌 (1) 紫外线灭菌：在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌。细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。 紫外线的波长为200300nm，其中以260nm的杀菌能力最强，但是紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，且要求距照射物以不超过1.2米为宜。,(2) 熏蒸灭菌：用加热焚烧、氧化等方法 ，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。 化学消毒剂能使微生物的蛋白质变性，或竞争其酶系统，或降低其表面张力，增加菌体细胞浆膜的通透性
3、，使细胞破裂或溶解。,一般说来，温度越高，作用时间越长，杀菌效果越好。消毒剂的浓度一般是浓度越大，杀菌能力越强，但石炭酸和酒精例外。 常用熏蒸剂是甲醛。熏蒸时，房间关闭紧密，按68ml/m3用量，将甲醛置于广口容器中，加g高锰酸钾促进挥发。冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛。,(四) 一些物体表面用药剂喷雾灭菌：物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手表面、植物材料表面等。可用70的酒精反复涂擦灭菌，12的来苏儿溶液以及0.251的新洁尔灭也可以。,(五)植物材料表面用消毒剂灭菌：从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基，便会造成培养基
4、污染。 首先，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净。 第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成，准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。用70%酒精浸10-30s。处理完的材料在无菌条件下，待酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料。,第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取12 种使用。 表42 常用灭菌剂使用浓度及效果比较 灭菌剂 使用浓度 持续时间(min) 去除的难易 效果 次氯酸钙 910% 530 易 很好 次氯酸钠 2% 530 易 很好 氯化汞 0.11% 58 较难 最好 抗菌素 450mg/L 3060 中
5、较好,而用升汞液灭菌的材料，因升汞残毒较难去除，应当用无菌水涮洗810次，每次不少于3min，以尽量去除残毒。,灭菌时，把沥干的植物材料转放到烧杯或其它器皿中，记好时间，倒入消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻底。 在快到时间之前12min，开始把消毒液倾入一备好的大烧杯内，要注意勿使材料倒出，倾净后立即倒入无菌水，轻搅涮洗。 灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止。,在灭菌溶液中加吐温-80或Triton X效果较好，这些表面活性剂主要作用是使药剂更易于展布，更容易浸入到灭菌的材料表面。但吐温加入后对材料的伤害也在增加，应注意吐温的用
6、量和灭菌时间，一般加入灭菌液的1.5%，即在100ml加入1.5滴。 最后一步是用无菌水冲洗，冲洗要每次3min左右，视采用的消毒液种类，冲洗310次左右。无菌水冲洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。,二、无菌操作,1、接种室要严格进行空间消毒。接种室内保持定期用1-3%的高锰酸钾溶液对设备、墙壁、地板等进行擦洗。 2、工作人员进入接种室前双手必须进行消毒，先用水和肥皂洗涤，操作前再用70%酒精擦试，操作时双手不能随便接触未经消毒的东西。 3、入室前穿好灭过菌的专用实验服，专用实验服要经常保持清洁并消毒。,4、操作规程过程禁止不必要的谈话和咳嗽。还要尽量减少工作人员在接种室内的走动。 5、
7、操作期间尽量把所用的器皿盖子盖好。刀、剪、镊子等用具，一般在使用前浸泡在70的酒精中，用时再在火焰上消毒，待冷却后使用。 6、每次使用前均需进行用具消毒。工作结束，及时取出接种材料，然后清理台面，再用的来苏儿或石炭酸全面喷雾或打开紫外线照射半小时。,三、接种,接种是将经严格的表面灭菌处理好外植体（如种子，根、茎、叶等离体器官），经切割或剪裁成小段或小块，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接种。 1、将初步洗涤及切割的材料放入烧杯，带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗最后沥去水分，取出放置在灭过菌的层纱布上或滤纸上。,2、材料吸干后，一手拿镊子，一手拿剪子或解剖刀，对材料进行适当的
8、切割。如叶片切成0.5cm见方的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含12片幼叶的茎尖大小等。在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。,3、用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。 具体操作是： 先解开包口膜，将培养瓶几乎水平拿着，培养瓶口靠近酒精灯焰，将瓶口在火焰上方转动，让瓶口里外灼烧数秒钟。 然后用镊子夹取外植体送入瓶内，轻轻插入培养基上。至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放(尖端向上)其它尚无统一要求。 放置材料数量现在倾向少放，一旦培养物污染可以抛弃。接完种后，将瓶口在火焰上再灼烧数秒钟，包上包口膜。,四、培养,培养是指把接种后的培养材料放在培养室(有光照
9、、温度条件)里，使之生长，分裂、分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。 （一）培养方法 1、固体培养法：即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。是现在最常用的方法 。 该法设备简单，易行。但养分分布不均，生长速度不均衡。并常有褐化中毒现象发生。,2、液体培养法：即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。由于液体中氧气含量较少，常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给，采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养，其速度一般为50100r/min，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。,(二) 培养步骤 1、初代培养：即接种某种外植体后，最初的几代培养。根据初代培养
10、时发育的方向可分为： (1) 顶芽和腋芽的发育：采用外源的细胞分裂素，可促使具有顶芽或没有腋芽的休眠侧芽启动生长。形成一个微型的多枝多芽的小灌木丛状的结构。,(2) 不定芽的发育：在培养中由外植体产生不定芽, 通常首先要经脱分化过程, 形成愈伤组织的细胞。然后，经再分化，即由这些分生组织形成器官原基，最后形成完整植株。多数情况下它先形成芽，后形成根。,(3) 体细胞胚状体的发生与发育：体细胞胚状体类似于合子胚但又有所不同，它也通过球形，心形，鱼雷形和子叶形的胚胎发育时期，最终发育成小苗。但它是由体细胞发生的。胚状体可以从愈伤组织表面发生，也可从外植体表面已分化的细胞产生，或从悬浮培养的细胞产生
11、。,初代培养外植体的褐变：,外植体褐变是指在接种后，其表面开始变褐，有时甚至会使整个培养基变褐的现象。 它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发生变化所致。 在褐变过程中，会产生醌类物质，它们多呈棕褐色，当扩散到培养基后，就会抑制其他酶的活性，从而影响所接种外植体的培养。,褐变的主要原因如下：,(1) 生理状态：外植体的生理状态不同，在接种后褐变程度也有所不同。 一般来说，处于幼年期的植物材料褐变程度较浅，而从已经成年的植株采收的外植体，由于含醌类物质较多，因此褐变较为严重。幼嫩的组织在接种后褐变程度并不明显，而老熟的组织在接种后褐变程度较为严重。,(2) 培养基成分：浓度
12、过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加，此外，细胞分裂素的水平过高也会刺激某些花卉外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。 (3) 培养条件不当：例如光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。,防止、减轻褐变现象发生的措施,(1) 选择合适的外植体：一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。 (2) 合适的培养条件：无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。,(3) 使用抗氧化剂：在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象
13、。另外使用0.10.5的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。 (4) 连续转移：对容易褐变的材料可间隔1224小时的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理710天后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。,实验四 植物外植体消毒和接种,【目的】 （2分） 学习和掌握植物外植体表面消毒的常规方法。 【原理】 （8分） 用于进行组织培养的组织、器管和细胞称为外植体。在植物组织培养中，外植体如果是带菌的，在接种前都必须进行表面消毒，这是取得培养成功的最基本的和重要的前提。常用消毒剂对外植体进行消毒。接种是将经严格的表面灭菌处理好的外植体，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接种。,【材料】
14、（2分） 水稻种子 【实验用品】 （3分） 1试剂：0.1氯化汞，75乙醇无菌水，无菌培养皿，MS培养基。 2器具：无菌纸，一次性手套，酒精灯，标签纸，记号笔，超净工作台，烧杯，镊子。,【实验步骤】 （15分） 1外植体的灭菌: 首先将水稻种子去壳，然后用75%酒精消毒30s，无菌水冲洗2次，再用0.1%氯化汞灭菌8 min，用无菌水清洗68次，每次清洗时间3分钟。 2接种前: 用75乙醇棉球檫拭超净工作台台面，将培养基及用具放人工作台，开超净工作台紫外灯和送风开关，照射20 min之后关闭紫外灯，继续通风10 min后，再开日光灯进行无菌操作。,3接种：将水稻种子先用无菌纸吸干水分。镊子使用
15、前插入75 乙醇溶液中，使用镊子时在酒精灯火焰上炽烧片刻，冷却后，取种子将有胚的一端向上，另一端插入培养基中。插入深度以种子的1/2长为宜，以上操作都要将培养瓶靠近火焰旁。每瓶放10-15粒种子。 4、接种完毕后将培养瓶封口，贴上标签，注明姓名，接种时间和材料名称。整理好超净工作台台面，搞好清洁卫生。,【实验结果与分析】 （50分） 接种后7天观察污染情况 污染率()=(污染的材料数/接种材料总数)100 对实验结果进行分析：（1）若无污染，请总结成功的经验；（2）若有污染，请说明导致污染的可能原因。,【思考题】 （20分） 1、实验人员进入接种室接种之前，应做哪些准备工作？ 2、在接种过程中
16、，通过哪些措施来防止细菌对接种工具、接种材料的污染? 3、外植体用消毒剂消毒后，为什么要用无菌水漂洗？为什么常在消毒溶液中加入12滴表面活性剂(如吐温)?,实验五 愈伤组织的诱导（初代培养）,【目的】 （2分） 学习诱导植物器官外植体形成愈伤组织的方法。 【原理】 （8分） 已有特定结构与功能的植物组织，在一定条件下，其细胞被诱导改变原来的发育途径，逐步逆转其原有的分化状态，转变为具有分生能力的胚性细胞，这个过程称为脱分化。来自于植物各种器官的外植体在离体培养条件下，细胞经脱分化等一系列过程，改变了它们原有的特性而转变形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团，即愈伤组织。,一般情况下，植物各器官和组织均有诱导产生愈伤组织的潜在可能性。植物生长调节剂是诱导愈伤组织形成的极为重要的因素。生长素是用于诱导愈
