培养基灭菌与空气净化课件

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1、第四章 培养基灭菌与空气净化,第一节 培养基灭菌的目的、要求和方法 第二节 培养基的湿热灭菌 第三节 空气净化（除菌）,第一节 培养基灭菌的目的、要求和方法,一、定义 1.培养基灭菌 指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及其孢子，或从中将其除去。,工业规模的液体培养基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌更为常用。,2.灭菌与消毒的区别 灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。 消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿内外的病源微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。,消毒不一定能达到灭菌要求，而灭菌则可达到消毒的目的。,1.在发酵过程中杂菌造成的后果：

2、生产菌和杂菌同时生长，生产菌丧失生产能力； 在连续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比生产菌生长得更快，结果使发酵罐中以杂菌为主； 杂菌及其产生的物质，使提取精制发生困难； 杂菌会降解目的产物：醋酸菌氧化乙醇 杂菌会污染最终产品：酿酒干酵母的杂菌 发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现象。,二、培养基灭菌的目的,1）使用的培养基和设备须经灭菌； 2）好氧培养中使用的空气应经除菌处理； 3）设备应严密，发酵罐维持正压环境； 4）培养过程中加入的物料应经过灭菌； 5）使用无污染的纯粹种子。,2.工业上控制杂菌的措施：,3.培养基灭菌的目的 杀灭培养基中的所有微生物，为后续发酵过程创造无菌的条件。,

3、4.培养基灭菌的要求 达到要求的无菌程度（10-3） 尽量减少营养成分的破坏。 在灭菌过程中，培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的： 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。,培养基中不同营养成分间的相互作用：羰氨反应,化学法 化学药品灭菌法 物理法 射线灭菌法：紫外线或电离辐射 空气的过滤除菌 干热灭菌法 湿热灭菌法,高温灭菌,三、灭菌的方法,：酒精,：SO2,连,苯并芘,关于灭菌和消毒的不正确的理解是（ ） A灭菌是指杀灭环境中的一切微生物的细 胞、芽孢和孢子 B消毒和灭菌实质上是相同的 C接种环用灼烧法灭菌 D常用灭菌的方法有加热法、过滤法、紫外 线法、化学药品法,谷氨酸棒状

4、杆菌的培养液常采用的灭菌方法是（ ） A高压蒸汽灭菌 B高温灭菌 C加入抗生素灭菌 D酒精灭菌,防腐（antisepsis）,防腐就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。 （1）低温 （4）高渗 （2）缺氧 （5）高酸度 （3）干燥 （6）防腐剂,一、湿热灭菌的原理 每一种微生物都有一定的生长温度范围。 当微生物处于最低温度以下时，代谢作用几乎停止而处于休眠状态。当温度超过最高限度时，微生物细胞中的原生质胶体和酶起了不可逆的凝固变性，使微生物在很短时间内死亡。,蒸汽具有很强的穿透能力，而且在冷凝时会放出大量的冷凝热，很容易使蛋白质凝固而杀死各种微生物

5、。,第二节培养基的湿热灭菌,蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒； 蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻底； 蒸汽有很大的潜热； 操作方便，易管理。,湿热灭菌的优点:,湿热灭菌中的相关概念,某些微生物对湿热的相对热阻（与大肠杆菌比较）,杀死微生物的极限温度称为致死温度。,致死温度（Death temperature）,热力致死时间 (Thermal Death Time; TDT), 在特定条件、特定温度下，杀死某种微生物所需的最短时间。,e.g 伤寒杆菌58 30min 变形杆菌55 60min,-利用一定温度进行加热, 90%的活菌被杀死时所需的时间(min)即为D值。又称1/10衰减时间。,D,D

6、 = 10 min,0 10 20 30 40 50 60,加热时间 (min),105,104,103,102,10,106,残 存 活 细 胞 数,残存活细胞曲线,D值,例： 含有某种细菌的悬液，含菌数为105/mL,在100（212F）的水浴温度中，活菌数降低到104/mL时所需的时间为10min,则该菌的D值即为10min。 D100 = 10min 如果加热的温度为121，则常写成Dr, 在加热致死时间曲线中，加热时间缩短90%所需升高的温度，即为Z值。,100 115,100,10,加 热时 间 （min),加热温度 （）,加热致死时间曲线,Z,Z = 15 ,Z 值, =(2.3

7、03/k)log(No/Ns) -灭菌时间（s） k-反应速度常数，与菌的种类和加热温度有关（s-1） No-灭菌开始时，污染的培养基中杂菌个数（个mL） Ns-经过灭菌时间T后，残存活菌个数（个mL）,二、理论灭菌时间,可见灭菌时间取决于污染程度(N0)、灭菌程度（残留菌数Ns）和值, 在培养基中有各种各样的微生物，不可能逐一加以考虑。一般只考虑芽孢细菌和细菌的芽孢数之和作为计算依据。, 灭菌程度，即残留菌数，如果要求完全彻底灭菌，即N = 0，则 为，上式无意义，事实上也不可能。 一般取N = 0.001，即1000次灭菌中有1 次失败。,例： 有一发酵罐内装40m3培养基，在121温度下

8、进行实罐灭菌。原污染程度为每mL有2105个耐热细菌芽孢， 121时灭菌速度常数为1.8min1。求灭菌失败几率为0.001时所需的灭菌时间。,将配制好的培养基放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程，也称实罐灭菌。,（一）间歇灭菌 （常用）,三、灭菌操作,240,160,120,80,时间（min),0,50,100,150,温度,升温,冷却,保温,培养基间歇灭菌过程中的温度变化情况,过程包括： 升温、保温和冷却三阶段。 各阶段对灭菌的贡献： 20%、75%、5%。,发酵罐,蒸汽,蒸汽,冷却水,无菌培养基,配料罐,泵,加热塔,维持罐,冷却管,（二）连续灭菌（又

9、称连消）,将培养基在发酵罐外通过连续灭菌装置进行加热、保温 和冷却而进行灭菌。,连续灭菌的基本设备有哪些 ？,问题,连续灭菌过程,连续灭菌的流程与设备,（1）配料预热罐，将配制好的料液预热到6070 ，以免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声； （2）连消塔，用高温蒸汽使料液温度很快升高到灭菌温度（126132 ）；,配料罐（兼作预热）,输料泵,连消塔（器）,维持罐（管）,冷却器,发酵罐,（3）维持罐，使料液在灭菌温度下保持57min。 因为：连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够的； （4）冷却管，使料液冷却到4050 后（冷水喷淋） ，输送到预先灭菌过的罐内。,连续

10、灭菌过程中温度的变化(虚线),（三）间歇灭菌与连续灭菌的比较,四、影响培养基灭菌的主要因素,1、微生物热阻,2、pH, 微生物在pH6.08.0范围内耐热性最大 pH低于6.0时，氢离子极易渗入微生物细胞，从而改变细胞的生理反应而促进其死亡，故培养基酸度愈高，则所需的杀菌时间愈短。,温度 孢子数 灭菌时间 (min) () (个/ml) pH=6.1 5.3 5.0 4.7 4.5 120 10000 8 7 5 3 3 115 10000 25 25 16 13 13 110 10000 70 65 35 30 24 100 10000 740 720 180 150 150,pH对灭菌时间

11、的影响,3、菌的浓度,浓度越高，所需灭菌时间越长,4、培养基成分, 油脂、糖类及一定浓度的蛋白质会增加微生物的耐热性 因高浓度有机物会环绕细菌的四周形成一层薄膜，影响热的传入。, 而高浓度的盐类、色素等则削弱其抗性,浓度较高的培养基相对需要较高温度和较长时间灭菌。,5、泡沫 泡沫中的空气形成隔热层，使热量难以渗透进去杀死其中潜伏的微生物； 易产生泡沫的培养基在灭菌时，可加入少量消泡剂。,6、颗粒 颗粒小，灭菌容易，颗粒大，灭菌难。,五、发酵罐的灭菌,培养基的灭菌如果是采用连续灭菌法，则发酵罐应在加入灭菌的培养基前先行单独灭菌。通常是用蒸汽加热发酵罐的夹套或盘管，并从空气分布管中通入蒸汽，充满整

12、个容器后，再从排气管中缓缓排出。容器内的蒸汽压力保持1公斤，20分钟。在保温结束后，关键是随即通入无菌空气，使容器保持正压，防止形成真空而吸入带菌的空气。,六、补料液的灭菌,在发酵过程中，往往要向发酵罐中补入各种不同的料液。这些料液都必需经过灭菌。 灭菌的方法则视料液的性质、体积和补料速率而定。 如果补料量较大，而具有连续性时，则采用连续灭菌较为合适。 也有利用过滤法对补料液进行除菌。 补料液的分批灭菌，通常是向盛有物料的容器中直接通入蒸汽。 所有的附属设备和管道都要经过灭菌。,无菌空气的概念 发酵工业应用的“无菌空气”是指通过除菌处理使空气中含菌量降低在一个极低的百分数，从而能控制发酵污染至

13、极小机会。 发酵对空气无菌程度的要求 一般按染菌机率为10-3。来计算，即1000次发酵周期所用的无菌空气只允许12次染菌。,第三节 空气净化,除尘；除水；除菌,空气中微生物的分布,空气中的含菌量随环境不同而有很大差异： 地域：一般干燥寒冷的北方空气中的含菌量较少，而潮湿温暖的南方则含菌量较多； 人口：人口稠密的城市比人口少的农村含菌量多； 空间：地面又比高空的空气含菌量多。 各地空气中所悬浮的微生物种类及比例各不相同，数量也随条件的变化而异，一般设计时以含量为103 104个米3进行计算。,空气中微生物(包括细菌、酵母、霉菌和病毒) ，一般附着在空气中的灰尘上或雾滴上。 灰尘粒子的平均大小约

14、0.6m左右，空气除菌主要去除空气中的微粒(0.61m）。,空气除菌的方法,（一） 辐射杀菌 （二） 热杀菌 （三） 静电除菌 （四） 过滤除菌（介质）,一、辐射灭菌 1.原理 射线、X射线、射线、射线、紫外线、超声波等从理论上讲都能破坏蛋白质，破坏生物活性物质，从而起到杀菌作用。,2. 应用范围 通常用于无菌室和医院手术室。 3. 缺点 杀菌效率较低，杀菌时间较长。一般要结合甲醛蒸汽等来保证无菌室的无菌程度。,紫外线对人体组织有一定刺激作用，眼睛、皮肤受照射后会产生某些症状。,二、加热灭菌,电热（218，24s, 效果可达99.9999%）， 目前大量处理空气，技术上还有困难,三、静电除菌

15、1.原理 利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘、除菌的目的。 2.优点 阻力小，约1.01325104Pa 染菌率低，平均低于10-15 除水、除油的效果好 耗电少 3.缺点 设备庞大 、一次性投资较大 、捕集率尚嫌不够，需要采取其它措施。 需高压电 （一般用于超净台）,四、空气过滤除菌的原理与介质,滤材,孔,使空气通过多孔介质（如棉花、活性炭、烧结玻璃、超细纤维丝等）将空气所携带的尘、菌截阻。,这是目前发酵工业中最广泛使用的方法,定义,1 微米 (m) 等于: 106 米 103 毫米 3.910 -5 英寸 又称 “micron“,微米,定义,小颗粒的相对尺寸,小颗粒的相对尺寸,1.过滤除菌的种类 绝对过滤：过滤介质的滤孔小于细胞和孢子。 如聚乙烯醇缩甲醛树脂（PVF）制成的0.3 m的微孔滤膜。 深层介质过滤：介质的孔隙一般大于微生物细胞。 如用棉花、玻璃纤维和颗粒活性炭填充的过滤器。,如：棉花纤维直径16-20m，充填系数为8%时，所形成的网格空