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1、第六章 发酵工程基本操作,第一节 严格消毒灭菌 第二节 氧的供给 第三节 空气除菌,第一节 严格消毒灭菌,控制有害微生物主要有以下几种措施,除菌的方法,培养基的加热灭菌（包括常压或蒸汽高压加热法） 空气的过滤除菌 紫外线或电离辐射 化学药物灭菌,培养基的灭菌,一、影响培养基灭菌的因素,1、pH值的影响 pH值对微生物的耐热性影响很大，pH为6.0-8.0时微生物最不易死亡， pH 6.0时氢离子易渗入微生物的细胞内。,2、培养基成分 培养基的成分中，油脂、糖类、蛋白质都是传热的不良介质，会增加微生物的耐热性，使灭菌困难。 浓度较高的培养基相对需要较高温度和较长时间灭菌。 高浓度的盐类，色素则削
2、弱其耐热性，故较易灭菌。,3、培养基中的颗粒物质 培养基中的颗粒物质大，灭菌困难，反之，灭菌容易。一般说来，含有颗粒对培养基灭菌影响不大，但在培养基混有较大颗粒，特别是存在凝结成团的胶体时，会影响灭菌效果，必须过滤除去。,二、灭菌的实际操作,（一）空罐灭菌 空罐灭菌也称空消。无论是种子罐、发酵罐、还是尿素（或液氨）罐、消泡罐，当培养基（或物料）尚未进罐前对罐进行预先灭菌，为空罐灭菌。 为了杀死所有微生物特别是耐热的的芽孢，空罐灭菌要求温度较高，灭菌时间较长，只有这样才能杀死设备中各死角残存的杂菌或芽孢。,（二）实罐灭菌 将培养基置于发酵罐中用蒸汽加热，达到预定灭菌温度后，维持一定时间，再冷却到
3、发酵温度，然后接种发酵，这叫做实罐灭菌，又称分批灭菌。 操作要点： 三路进汽：直接蒸汽从通风、取样和出料口进入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持一定的时间。这就是所谓的“三路进气”。,培养基连消工艺流程图,（2）过滤除菌法 是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌目的。在体外培养时，过滤除菌大多用于遇热容易变性而失效的试剂或培养液。,（3）其他方法 在配制培养基时，为避免发生沉淀，一般应按配方逐一加入各种成分。 另外，加入0.01EDTA或0.01NTA（氮川三乙酸）等螯合剂到培养基中，可防止金属离子发生沉淀。 最后，还可以用气体灭菌剂如氧化乙烯等对个别
4、成分进行灭菌处理。,三、化学杀菌剂或制菌剂,（一）表面消毒剂,常用消毒剂的种类很多，它们的杀菌强度各不相同。但几乎都有一个共同规律，即当其在极低浓度时，常常会对微生物的生命活动起刺激作用，随着浓度逐渐增高，就相继出现制菌和杀菌作用，因而形成一个连续的作用谱。 表面消毒剂是指对一切活细胞都有毒性，不能用作活细胞内的化学治疗用的化学药剂。,为比较各种表面消毒剂的相对杀菌强度，常采用在临床上最早使用的消毒剂石炭酸作为比较的标准，并提出了石炭酸系数这一指标。 所谓石炭酸系数，指在一定时间内被试药剂能杀死全部供试菌的最高稀释度与达到同效的石炭酸的最高稀释度的比率。一般规定处理时间为10分钟，而供试菌定为
5、Salmonellatyphi（伤寒沙门氏菌）。,消 毒 试 验, 以人工染菌实物为消毒对象，模拟现场表面污染大肠杆菌液。 消毒前采样：放置无菌规格板，取无菌棉拭于含5ml稀释液试管中沾湿， 在规格板空心处旋转自左至右涂抹整个区域 消毒后采样：在前采样地点旁用0.05过氧乙酸溶液消毒物体表面，30分钟后将无菌棉 拭于含5ml采样液试管中沾湿，作为消毒后样液。 将消毒前后样液充分振荡摇匀后稀释 培养待凝固后37培养2448小时，作菌落计数。,灭菌效果监测,、高压蒸气灭菌效果监测 (1) 高压蒸气灭菌指示卡：将卡片放入灭菌器不同部位，观察灭菌后指示卡颜色变化。 (2)芽胞菌片法：将每片染有嗜热脂肪
6、杆菌芽胞105cfu/ml的菌片包好、放入灭菌器内。灭菌后作细菌计数测定。 对照是不经灭菌的菌片，芽胞完全被杀灭或杀来率达99.9999为合格。,、紫外线消毒效果监测 微型紫外线强度计：使用时打开仪器开关，装入电池，打开电源开关 ，接通电源，将测定电压转换开关拨至电压一方，此时指针应超过中线。 测定时，将测定电压转换开关拨至测定一方，打开紫外线灯照射分钟后，将紫外线灯强度计置于紫外线灯下垂直的中央进行照射， 直至仪表指针稳定，所示之值即为该紫外线灯的强度值(uw/cm2) 。,(2)紫外线强度与消毒剂量指示卡： 测定灯管强度时，将卡片置于离紫外灯管的中央处，将图案一面朝向灯管，照射一分钟（照射
7、时间要准确）后，图案正中涂层由白色变为紫红色。与周围相应色块相比，可测知所照射的强度。 新灯管以不低于100uw/cm2为合格，旧灯管低于70uw/cm2应更换。,第二节 空气的净化,一、空气中微生物的分布,空气中微生物的含量和种类，随地区，季节和空气中灰尘粒子多少，以及人们的活动情况而异。 .北方气候干燥，寒冷，空气中的含菌量较多，离地面越高，含菌量越少；一般每升高10米，空气中的含菌量就降低一个数量级； 城市的空气中含菌量较多，农村的空气中含菌量较少，一般城市空气中杂菌数为30008000个米3 。,空气中的微生物种类以细菌和细菌芽胞较多，也有酵母，霉菌和病毒。 这些微生物大小不一，一般附
8、着在空气中的灰尘上或雾滴上，空气中微生物的含量一般为103104个米3。 灰尘粒子的平均大小约0.6m左右，所以空气除菌主要是去除空气中的微粒(0.6-1m ）,二、空气除菌,工业发酵对空气处理的要求随发酵产品和菌种不同而异。 半固体制曲和酵母生产中无菌要求不十分严格，一般无需复杂的空所净化处理； 密闭的深层通气发酵需严格的纯净培养，进入发酵罐前空气必须进行冷却、脱水、脱油和过滤除菌等处理。,（二）发酵对空气无菌程度 的要求,好气性发酵过程中需要大量的无菌空气，空气要作到 绝对无菌在目前是不可能的，也是不经济的。 发酵对无菌空气的要求是 ：无菌，无灰尘，无杂质，无水，无油，正压等几项指标； 发
9、酵对无菌空气的无菌程度要求是：只要在发酵过程中不因无菌空气染菌，而造成损失即可。 在工程设计中一般要求1000次使用周期中只允许有一个菌通过，即经过滤后空气的无菌程度为N=10-3,二、空气除菌的方法,（一） 辐射杀菌 （二） 热杀菌 （三） 静电除菌 （四） 过滤除菌,一辐射灭菌法,最常用的是用紫外光线进行无菌室灭菌。无菌室常用的紫外灯功率为30W，安装在操作台上方一米左右高处，每次照射15-30min既可。 紫外线有很强的杀菌力，但穿透力很弱，一张薄纸即可完全挡住紫外线，因此待灭菌物品必须置于紫外光直接照射下，而且在一定范围内作用强度与距离平方成反比。,此外，紫外线对人体组织有一定刺激作用
10、，眼睛、皮肤受照射后会产生某些症状，所以工作人员在无菌室操作时应关闭紫外灯,二、热灭菌,原理：基于加热后微生物体内的蛋白（酶）热变性而得以实现。 热空气进入培养系统之前，一般均需用压缩机压缩，提高压力。 空气压缩后温度能达到200度以上，保持一定时间后，便可实行干热杀菌。,利用空气压缩时所产生的热量进行灭菌的原理对制备大量无菌空气有特别意义。 实际应用中需考虑培养装置与空气压缩机的相对位置，连接压缩机与培养装置的管道的灭菌以及管道长度等。,三、静电除菌,静电除尘器可除去空气中的水雾、油雾、尘埃，同时也除去微生物。 原理：利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘灭菌目的。 对于一些直径小的微粒，所带
11、电荷小，不能被吸附而沉降。,电 除 尘 电 源,四、介质过滤除菌,介质过滤除菌是使空气通过经高温灭菌的介质过滤层，将空气中的微生物等颗粒阻截在介质层中，而达到除菌的目的。 从可靠性，经济适用与便于控制等方面考虑，目前仍以介质过滤法较好，也是大多数发酵厂广泛采用的方法。,发酵生产中制备无菌空气的大致过程,一、对空气除菌流程的要求,要制备较高无菌程度，具有一定压力的无菌空气，它的流程设备有空气压缩机。 附属设备要求尽量采用新技术，提高效率，减少设备，精简设备投资、运转费用和动力消耗，简便操作。 流程的制订就根据所在的地理、气候环境和设备条件而考虑。,在环境污染比较严重的地方，要考虑改变吸风的条件，
12、以降低过滤器的负荷，提高空气的无菌程度； 在温暖潮湿的南方，要加强除水设施，以确保和发挥过滤器的最大除菌效率； 在压缩机耗油严重的设备流程中则要加强消除油雾的污染等等。,二、空气除菌流程分析,要保持过滤器有比较高的过滤效率，应维持一定的气流速度和不受油、水的干扰。 气流速度可由操作来控制； 要保持不受油、水干扰则要有一系列冷却、分离、加热的设备来保证空气的相对湿度在50%60%的条件下过滤。,高空取气管,高空取气管是远离地面几十米的管子。一般而言，地面附近空气中所含的微生物和灰尘等均比高空空气中含的多，据资料介绍，每升高10米，空气中杂菌可降低一个数量级，因此从高空取气要比从低空取气有利得多。
13、,油水分离器,其内部同时采用直接拦截，惯性碰撞，布朗扩散及凝聚等机理，能有效地去除空气中的水、油雾、尘埃，内部不锈钢丝网可清洗，使用寿命长。,两级分离、冷却、加热的空气除菌流程,粗过滤器 压缩机 贮罐 冷却器 丝网分离器 过滤器,高效前置过滤除菌流程,高效前置过滤器 压缩机 贮罐 冷却器 丝网分离器 加热器 过滤器,空气净化的流程,吸气口吸入的空气先经过压缩前的过滤 进入空气压缩机（120-150度） 冷却（20-25度），除去油、水，再加热至30-35度。 最后通过总过滤器和分过滤器除菌，获得洁净度、压力、温度和流量都符合要求的无菌空气。,二、过滤除菌设备原理,概述： 目前发酵工厂采用的空气
14、过滤设备大多数是传统的深层过滤设备，滤层厚度一般为12米，所用的过滤介质一般是棉花、活性炭，也有采用玻璃纤维、焦炭等。 对不同的材料，材料的不同规格，材料的填充情况不同，都会得到不同的过滤效果。为了制取适合要求的无菌空气，就得深入研究深层过滤的各种关系。,（一）深层过滤原理,深层过滤所用的过滤介质棉花的纤维直径一般为1620微米。 充填系数为8%时，棉花纤维所形成网格的孔隙为2050微米，微粒大小为(0.5-2微米)。 微粒随气流通过滤层时，滤层纤维所形成的网格阻碍气流前进，使气流出现无数次改变运动速度和运动方向，绕过纤维前进； 这些改变引起微粒以对滤层纤维产生惯性冲击、阻拦、重力沉降、布朗扩
15、散、静电吸引等作用而把微粒滞留在纤维表面上。,空气过滤除菌介质,、棉花：纤维细长，16-20um，填充150-200kg/立方米 、玻璃纤维：直径8-19um，直径越小越好，但小易断，缺点：更换时碎末飞扬，过敏 、活性炭 ：大表面，物理吸附，空气阻力小，常夹带在二层棉花中降低阻力，为整个过滤器的1/3-1/2 、超细玻璃纤维纸:以拦截为主，直径1-1.5um，有较高过滤效率。缺点为强度差，受温后纤维松散。只用于分过滤器。可加入木浆纤维或其他纤维或采用树脂并加疏松剂。,、石棉滤板：蓝石棉20加80纸将混合打浆。温强度大，过滤效率低，耐蒸气反复杀菌。 、烧结材料过滤介质：聚乙烯醇过滤板。 、新型过
16、滤介质 ：微孔滤膜,提高过滤除菌效率的措施,鉴于目前所采用的过滤介质均需要干燥条件下才能进行除菌，因此需要围绕介质来提高除菌效率。,（1）设计合理的空气预处理设备，选择合适的空气净化流程，以达到除油、水和杂质的目的。 （2）设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率高的过滤介质。 （3）保证进口空气清洁度，如加强生产场地卫生管理，正确选择进风口，加强空气压缩前的预处理。 （4）降低进入空气过滤器的空气相对湿度，如使用无油润滑的空气压缩机，加强空气冷却和去油，提高进入过滤器的空气温度。,过滤器失效,压缩空气进入过滤器后便引起活性炭颗粒之间相互顶撞与摩擦，久而成为粉末(灰化)，活性炭的体积也逐渐变小，于是过滤器内的空间逐渐增大，到达-定程度时，便会发生棉花成90翻身现象。这样空气便会未经过滤而进入罐内，引起染菌。,棉花经过多次加热灭菌后，颜色逐渐变深，靠近过滤器壁的棉花，
