体外分析技术课件

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1、1,第五章 体外放射分析技术,In Vitro Radioassay,2,定义与分类,一、体外放射分析技术：在体外实验条件下，以特异性结合反应为生物学基础，以结合反应动力学规律为共同方法学基础，利用核射线对体内的各种生物活性物质进行体外定量分析的各种方法。 二、分类： 1、竞争性体外放射分析法（如RIA） 2、非竞争性体外放射分析法（如IRMA） 3、由体外放射分析技术派生出来的非放射性标记免疫分析技术（酶、化学发光、时间分辨荧光分析）,3,第一节 放射免疫分析法radioimmunoassay， RIA,1959年，美国的两位科学家Berson和Yalow首次将示踪技术的高度灵敏性和免疫学抗

2、原-抗体结合的高度特异性结合起来，创立了放射免疫分析技术，开创了生物活性物质微量测定技术的新时代。RIA 的特点：灵敏度高、特异性强、准确度高、稳定性好。经不断改进，现在广泛应用于临床检测和科学研究的很多领域。,4,一、基本原理,竞争性抑制 被测量的微量物质Ag（未标记抗原）和标记有放射性核素的该种物质*Ag(标记抗原)对其抗体Ab有相同的结合能力，反应时， Ag和 一定量的*Ag竞争有限量的Ab。生成的*AgAb的量随Ag的增加而减少，呈负相关关系。 反应达到平衡后，分离*AgAb （B）与*Ag（F），B、F或B/F与Ag的量呈函数关系，利用这一函数关系求出待测抗原的的浓度。,5,反应式,

3、6,具体方法,用一系列浓度已知的标准抗原（浓度递增的标准品）在严格相同的条件下与一定量的*Ag和有限量的Ab共同反应，反应达到平衡后，分离B与F，测定B的放射性做为纵坐标，以每一反应管的标准品浓度为横坐标，绘成标准曲线。根据被测抗原试管中的B的CPM值在标准曲线上求出该抗原的浓度,7,函数式,8,标准曲线,9,得到的标准曲线之所以是曲线而不是直线，这是可逆反应的质量作用定律决定的。函数式见上图 根据放射免疫分析法的基本原理，建立放射免疫分析必须具备以下技术条件： 1、可靠的标准品 2、高比活度的标记品 3、高亲和力的抗体 4、合适的分离技术 5、理想的曲线拟合方式,10,二、基本方法,（一）基

4、本试剂 放射免疫分析反应需要三种基本试剂： 1、标准品（非标记标准抗原） 2、标记抗原 3、抗体,11,1、标准品,标准品是样品定量的基础，它的质和量的变化直接影响待测样品的测定值。 对标准品的要求如下： 1）标准品和待测样品应属于同一种物质； 2）在与抗体反应时，标准品和待测样品应有相同的活性和亲和能力； 3）高度纯化，不含有影响分析的杂质； 4）对标准品的定量一定要精确,12,2、标记抗原,标记抗原是样品测量的基础 对标记抗原的要求是： 1）比活度和放射化学纯度必须足够高以保证分析的灵敏度 标记抗原的放化纯必须不小于95% 2）放射性核素的半衰期合适 3）标记抗原的生理活性未改变 4）标记

5、抗原的应有较高的稳定性,13,3、抗体,在放射免疫分析中，抗体质量的好坏是影响放射免疫分析的关键因素之一。 高质量的抗体必须具备三个条件： 高亲和力、高特异性、高滴度,14,1）高亲和力,只有高亲和力的抗体才能得到斜率高的标准曲线，而斜率高的标准曲线是高灵敏度和高精密度的必备条件。亲和力测定方法最常用的是Scatchard作图法（P36） KA值越大（即直线斜率越大），抗体的亲和力越大方法的灵敏度和精密度越高,15,2）高特异性,抗体必须与反应系统中抗原以外的物质尤其是抗原类似物结合得少，以免影响分析结果 抗体特异性的测定： 方法：测抗体的交叉反应率 交叉反应率越小，抗体的特异性越高,16,3

6、）高滴度,滴度 是抗体实际应用时的稀释倍数 抗体的滴度越高，其中的干扰物质的影响就越小。 滴度的测定：以一定浓度的*Ag与稀释度不同的抗体进行反应，当*Ag的结合率为50%时对应的抗体的稀释度即为该抗体的滴度。这时的抗体浓度就是实际使用时的浓度。,17,（二）分离技术,1、聚乙二醇（PEG）沉淀法 2、双抗体沉淀法 3、双抗体+PEG法 4、葡萄球菌A蛋白（SPA）沉淀法 5、活性炭吸附法：葡聚糖包被的活性炭 6、微孔滤膜过滤法：玻璃或醋酸纤维滤膜 7、磁化分离技术：氧化铁-活性炭（-抗体） 8、固相分离技术： 1）第一抗体与试管联接 2）第二抗体与试管联接,18,（三）数据处理,1、logi

7、t-log模型 2、四参数logistic模型： 3、四参数质量作用定律模型 U=（A-D）/1+（X/C）B+D 其中U为各试验管结合率（含NSB） A、B、C、 D分别为0剂量时的结合率， logit-log函数的斜 率，各点实际结合率下降一半时X的量，NSB。,19,三、质量控制 Quality Control , QC,（一）定义：质量控制 就是控制误差，即对分析工作中的误差进行经常性的检查，遇有质量异常则及时采取对策，以保证分析误差控制在可接受的范围内。 放射免疫分析是一类高灵敏度的超微量分析技术，极易受各种因素的影响而使检测结果失真，因此必须有严格的质量控制体系。,20,（二）误差

8、的来源,1、系统误差：这种误差表现为检测结果呈倾向性的偏高或偏低，常有一些可以确定的因素导致，如：量器不准、试剂不纯、标准品的定量不准、仪器状态不佳、分离效果不好、不适当的曲线拟合模型等等，系统误差是通过努力可以消除的。 2、随机误差：这种误差多由难以确定且无法控制的原因引起，误差的出现是随机的，由各种偶然因素造成，符合正态分布，如量取液体或分离时的误差。,21,（三）实验室内部质量控制,实验室内部质量控制侧重对检测质量的控制，它保证从收集样本开始到发出报告为止的全过程中，能及时发现检测过程中出现的各种误差，分析产生的原因，找出纠正的办法，以确保检测的质量。 常用以下指标对检测结果做可靠性评价

9、：精密度、准确度、特异性、灵敏度、稳定性、有效性,22,1、精密度（precision）是指在相同条件下对某一样品多次检测所得结果的符合程度，即复管的重复性，它是最重要的质量参数。 常用精密度图来评价实验室内部的精密度水平。 2、准确度（accuracy）是指测定值与真值的接近程度，用回收率来评价，回收率是反应测定值偏差的质控指标。 3、灵敏度（sensitivity）是指检测能与零剂量区分的最小检测量。 累计10次测定结果，计算出零标准管的结合率为X2SD时对应的剂量值，即为灵敏度。,23,4、特异性（specificity）是指该反应体系不受干扰物质物质影响的程度。常用的指标是交叉反应率。

10、 5、稳定性（stability）是指测定试剂在合理保存和正确使用条件下，在规定的有效期内，保持其全部原有性能不变的能力。常用指标有：零标准管结合率（B0%20%）、非特异性结合率（NSB%5%）、标准曲线上的质控指标等。 6、有效性（effectivity）主要指临床诊断符合率及临床使用评价，检测结果在正常和异常之间有良好的区分，得出可信的结论。,24,第二节 免疫放射分析 immunoradiometric assay , IRMA,免疫放射分析技术是1968年由Miles和Hales创立的，IRMA是非竞争性体外放射分析技术的代表。,25,一、基本原理,用放射性核素标记抗体作示踪剂，在反

11、应系统中加入过量的标记抗体，抗原与标记抗体进行全量反应，多余的抗体用一定的手段除去，测定复合物的放射性，其活度与待测抗原量正相关。,26,RIA和IRMA低剂量区的不确定因素示意图,27,IRMA的标准曲线,28,IRMA的特点,1、属于非竞争性抗原抗体结合反应； 2、抗原抗体复合物的与抗原的量正相关 3、在低剂量区不会有不确定因素 4、IRMA的非特异性结合对低剂量区的影响大,29,二、基本方法,1、双抗体夹心法 2、标记第三抗体法 3、生物素-亲和素系统的应用,30,31,32,RIA和IRMA的区别,33,体外分析常用检查项目 项目 方法及正常值 临床意义 T3 放免 1.0-3.2nm

12、ol/l 判断甲状腺功能及肾病肝病 糖尿病肿瘤心肌梗死等引起的低T3T4综合征 T4 放免 70-180nmol/l 同上 FT3 放免 3.2-9.2pmol/l 同上，判断甲亢复发及妊娠 时甲状腺功能 FT4 放免 8.2-26pmol/l 同上 甲状腺球 放免30% 甲状腺自身免疫疾病特异指 蛋白抗体 标，桥本氏甲状腺炎,34,甲状腺微 放免20% 甲状腺自身免疫疾病特异指 粒体抗体 标，桥本氏甲状腺炎 TSH 免放 0.4-3.1IU/ml 鉴别原发与继发甲低,评价下 丘脑-垂体-甲状腺轴功能,垂体瘤,库欣综合征 甲状腺 放免4-14.5g/ml 诊断甲癌慢性淋巴细胞性 球蛋白 甲状腺

13、炎/甲亢,尤其监测甲癌 复发 反T3 放免 0.5-1.2nmol/l 诊断甲状腺疾病,对非甲状腺 疾病严重程度的判断预后疗效观察均有重要意 义,甲减替代治疗观察 TSH受体 放射受体9U/l 甲亢甲亢预后,甲亢ATD停 抗体 药指标.判断甲亢有无复发.,35,促甲状腺素 放免法4325pg/ml 鉴别原发和继发性释放激素 甲低 甲状旁腺素 放免 70.5pmol/l 甲状旁腺病,判断骨代谢. 慢性肾衰甲旁亢甲旁腺瘤时增高, 甲旁减高钙尿症时减低 肿瘤标志物 铁蛋白 放免 ,男25264g/l 缺铁性贫血,辅助诊断再障急 女25264g/l 慢性白血病恶性淋巴瘤多发 性骨髓瘤。原发性肝癌部分

14、升高，肿瘤骨髓、肝、脾转移时显著增加 前列腺特 放免，2.6g/l 前列腺癌前列腺肥大前列腺炎诊 异抗原 断及疗效观察.前列腺癌时显著升高,肥大时轻度升高.,36,CEA 放免，20g/l 结肠直肠胃肺乳腺恶性肿瘤时动态 升高,对肿瘤诊断复发预后判断疗效观察有意义. AFP 放免，25g/l 诊断原发性肝癌.急慢性活动性肝炎 胎儿畸形也可升高.可作肝癌手术和 化疗后预后观察. NSE 放免，15g/l 小细胞未分化肺癌脑神经母细胞瘤神 经内分泌肿瘤脑损伤 降钙素 放免，29.3pmol/l 甲状腺隋样瘤,早期诊断小细胞肺癌,甲 亢时异常升高,判断肾功能钙磷代谢. 前列腺酸性 放免，4g/l 前

15、列腺癌时明显升高,肥大时轻度升高, 磷酸酯酶 可作前列腺癌疗效监测. 血2微球 放免，2300g/l 多发性骨髓瘤肝胃结肠癌白血病时 蛋白 显著升高.慢性肾炎和肾衰时血浓度升高.,37,糖类抗原 放免20mg/l 肿瘤诊断预后, 放化疗及手术后的疗CA-50 效观察 CA-199 放免37U/ml 胰腺癌胆管癌阳性检出率高,结肠癌胃 癌肝癌等辅助诊断和疗效随访. CA-242 放免25U/ml 胰腺癌肝癌诊断,高特异 CA-125 放免35U/ml 妇科肿瘤的诊断与鉴别诊断有重要价值 CA-153 放免30U/ml 乳癌诊断特异,乳癌肝及骨转移卵巢癌 子宫内膜癌一定程度增高 肾上腺及肾脏 尿免疫球蛋白 放免8mg/l 早期诊断肾脏受损受损部位及程度判断 尿白蛋白 放免10mg/l 同上 尿2微球蛋白 放免230mg/l 同上,38,血浆皮质醇 RIA