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1、金磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原免疫学检测方法的建立,答 辩 人 付 强 专 业 生物化学与分子生物学 指导老师 崔亚丽 教授 答辩日期 2007-5-31,西北大学硕士研究生论文答辩,1,答辩内容, 背景介绍 研究报告 金磁微粒为载体的磁分离酶联免疫法检测乙肝病毒表面抗原方法的建立 金磁微粒为载体的化学发光酶免疫分析法检测乙肝病毒表面抗原方法的建立 全文总结 致谢,西北大学硕士研究生论文答辩,2,西北大学硕士研究生论文答辩,背景介绍,乙型肝炎病毒概述, 乙肝病毒（HBV）是一种嗜肝性DNA病毒，它是引起乙型病毒性肝炎的病原体。,电镜下HBV 颗粒的三种形态 （摘自N Engl J Med 2
2、004, 350: 1118-29）,HBV结构模拟图,3,西北大学硕士研究生论文答辩,背景介绍,乙肝病毒表面抗原（HBsAg）,4,HBsAg 种类,大蛋白（L HBs）,中蛋白（M HBs）,主蛋白（S HBs）,西北大学硕士研究生论文答辩,背景介绍,5,HBsAg的主要作用,介导病毒进入宿主细胞 诱导机体产生保护性抗体 （HBsAb） 早期诊断的血清学标志,乙肝病毒表面抗原的常用免疫学检测方法比较,西北大学硕士研究生论文答辩,背景介绍,6,西北大学硕士研究生论文答辩,以磁性微粒为载体的磁分离酶联免疫技术（MAIA）,背景介绍, 磁性微粒的定义：磁性微粒(magnetic particle
3、s)，又称磁性微球(magnetic beads或magnetic microspheres)， 是由超顺磁性纳米粒子与高分子或其它无机材料复合形成的胶态颗粒。,7,GoldMagTM-AS 微米金磁微粒,磁分离酶联免疫法(magnetic affinity immunoassay, MAIA)是20世纪80年代中期由瑞士Serono诊断中心发明的一种免疫检测新技术 。 MAIA技术具有灵敏度高、检测速度快、特异性高、重复性好、无放射性污染等优点，在医学检测、食品安全检测等领域有着很好的应用前景。,西北大学硕士研究生论文答辩,化学发光免疫技术,背景介绍,概念： 集灵敏的化学发光分析和特异的抗原
4、抗体免疫测定于一体的检测技术。 特点： 特异性高，敏感性高，操作简便、快速，试剂无毒，安全稳定，可自动化。 目前，已有许多将化学发光免疫技术应用于临床检测的研究报道。如应用化学发光免疫分析法定量检测乙肝病毒标志物1，磁分离-酶标记-化学发光法测定促甲状腺素2等；相关的检测仪器，如：ACCESS 化学发光免疫分析仪(美国Beckman Coulter 公司),8,1. 化学发光免疫分析定量检测乙肝病毒标志物方法学研究，标记免疫分析与临床，2004, (11)3: 157159. 2. 磁分离-酶标记-化学发光法测定促甲状腺素的应用，国外医学临床生物化学与检验学分册，2005, (26)4: 19
5、3198.,西北大学硕士研究生论文答辩,以金磁微粒为载体的HBsAg免疫学检测方法原理图,背景介绍,9,西北大学硕士研究生论文答辩,研究目的及意义, 研究目的,以金磁微粒为载体，建立乙肝病毒表面抗原（HBsAg）的免疫学检测方法，并用标准HBsAg血清盘对该方法进行验证和比较，以期开发新的检测系统用于HBsAg 的检测。,背景介绍, 研究意义,HBsAg的检测可用于体检、献血员筛选、血液制品的复检、了解乙肝病毒感染者的感染状况、疗效观察及预后评估，另外还用于乙型肝炎的流行病学调查。,10,实验I,西北大学硕士研究生论文答辩,. 以金磁微粒为载体的磁分离酶联免疫法检测乙肝病毒表面抗原,HBV表面
6、抗体在金磁微粒表面的包被 包被抗体和酶标抗体最佳工作浓度的选择 温育时间的选择 显色时间的选择 精密度考察 灵敏度考察 特异性考察,11,实验I,西北大学硕士研究生论文答辩,HBV表面抗体在金磁微粒表面的包被,包被前抗体溶液在280 nm处具有明显的光吸收，包被反应完毕后剩余溶液在280 nm处几乎没有光吸收出现，说明抗乙肝病毒表面抗原单克隆抗体几乎全部包被在金磁微粒表面。,HBsAb包被前后的紫外吸收曲线,12,实验I,西北大学硕士研究生论文答辩,包被抗体和酶标抗体最佳工作浓度的确定,不同量的包被抗原和不同稀释度的HRP-标记抗原条件下检测的阳性和阴性血清结果 注：P：阳性血清；N：阴性血清
7、,酶标 抗体稀释度,抗体包被量 （ng/孔）,当控制阳性对照OD值在2.0以上，阴性对照OD值在0.05以下（小于0.05，以0.05计）时，有三个方案可满足此条件，为了减少实验成本，我们选择抗原包被量为200ng/孔，酶标抗体1:1000稀释作为本实验的最佳条件 。,13,实验I,西北大学硕士研究生论文答辩,温育时间的选择,吸光度值随温育时间的变化,本实验中，选用温育时间为25 min，此时抗原抗体反应已达平衡，且时间波动对吸光度值影响较小。,14,实验I,西北大学硕士研究生论文答辩,显色时间的选择,不同显色时间下的检测结果,本实验中，显色时间为15 min时，非特异性的值较高，而显色10
8、min和显色5 min相比，阳性值和阴性值均变化不大，说明5 min时，显色反应已达平衡。因此，选择5 min作为最佳的显色时间。,15,实验I,西北大学硕士研究生论文答辩,临界值 (Cut-off ) 的确定,16,平均值OD值：X= 0.05,根据常用的临界值判定标准来计算该方法的临界值，即为阴性对照平均值2.1，阴性对照平均值 0.05时，阴性对照值以0.05计算，得Cut-off值为0.105，我们将OD = 0.105 作为本实验中判定阳性血样的临界值。,实验I,西北大学硕士研究生论文答辩,金磁微粒为载体HBsAg检测系统的精密性检测结果,除一组检测外，方法的批内相对标准偏差（RSD
9、）均小于5%，批间RSD仅为2.03%。另外，用该系统对HBsAg国家参考标准品也进行了精密度测定，检测10份样品的相对标准偏差（RSD）为8.3%，这符合HBsAg国家参考标准品的精密度要求（RSD应小于15%）。说明金磁微粒为载体HBsAg检测系统的精密性较好。,17,实验I,西北大学硕士研究生论文答辩,灵敏度考察,金磁微粒为载体HBsAg检测系统的灵敏度检测结果,商品化的ELISA试剂盒的灵敏度检测结果,注：OUT表示所测值超出仪器的检测范围,18,实验I,西北大学硕士研究生论文答辩,特异性考察,用本系统检测HBsAg国家参考品的20份阴性血清及3份强阳性血清，结果显示，阴性符合率为10
10、0% (20/20)，阳性符合率为100% (3/3)。此外检测了203份献血者的血样，其结果与应用商品化试剂盒的结果一致。同时检测了81份HBsAg阴性献血者的血样，其阴性符合率为100% (81/81)。,19,实验I,西北大学硕士研究生论文答辩,小 结,建立了以金磁微粒为载体，检测血清中HBsAg的方法。 精密性试验表明，应用该法检测阳性血清及阴性血清时，方法的批内及批间相对标准偏差在1.20 7%的范围，符合临床检测要求。 选用卫生部临床检验中心的HBsAg国家参考品对本系统进行灵敏度分析，结果显示乙肝病毒表面抗原adw，adr，ay三种亚型的最低检出浓度分别为0.5 ng/ml，0.
11、5 ng/ml及 1.0 ng/ml；符合HBsAg国家参考品灵敏度检测的标准，且与目前商品化ELISA试剂盒的检测水平相当。 用该方法检测献血员血清时，与商品化试剂盒的检测结果一致 。 金磁微粒包被抗体后，不影响其生物学活性，可成功应用于免疫学检测。研究和开发以其为载体的血液中HBsAg的免疫学检测方法对于血站筛查及临床研究具有非常重要的意义。,20,实验II,西北大学硕士研究生论文答辩,.金磁微粒为载体的化学发光酶免疫分析法检测乙肝病毒表面抗原方法的建立,HBsAb在金磁微粒表面的包被 最佳化学发光检测条件的确定 标准曲线的制作 精密度考察,21,实验II,西北大学硕士研究生论文答辩,HB
12、sAb在金磁微粒表面的包被,HBsAb包被前后的紫外吸收曲线,22,实验II,西北大学硕士研究生论文答辩,化学发光检测缓冲体系的选择,23,缓冲体系对化学发光信号有很大的的影响。 本实验中选择CBS体系为化学发光检测的最佳缓冲体系。 同时选择CBS缓冲体系的最佳浓度为0.1 mol/L。,实验II,西北大学硕士研究生论文答辩,体系pH值对化学发光信号的影响,pH在8.0 9.5范围内，发光信号随pH升高而增强，在pH 9.5时发光信号最大；pH值大于9.5时，发光信号随着pH值的增大而逐渐降低，所以本实验选择pH 9.5，0.1 mol/L CBS缓冲液为缓冲介质。,24,实验II,西北大学硕
13、士研究生论文答辩,发光试剂的浓度的选择,实验中对鲁米诺、过氧化氢及对碘苯酚（PIP）的浓度对HBsAg测定的化学发光信号影响做了考察。结果表明，当鲁米诺溶液、过氧化氢溶液、对碘苯酚溶液的浓度分别为510-4 mol/L, 110-3 mol/L和110-3 mol/L时，化学发光信号值最大。因此，本实验选择鲁米诺溶液、过氧化氢溶液、对碘苯酚溶液的浓度分别510-4 mol/L, 110-3 mol/L和110-3 mol/L。,25,实验II,西北大学硕士研究生论文答辩,检测体系的最优条件,HBsAb包被量：200ng/孔；酶标抗体为1：1000稀释。 温育时间：25分钟。 化学发光检测的缓冲
14、体系：pH 9.5，0.1 mol/L CBS缓冲液。 鲁米诺溶液、过氧化氢溶液、对碘苯酚溶液的浓度分别510-4 mol/L, 110-3 mol/L和110-3 mol/L。,26,实验II,西北大学硕士研究生论文答辩,HBsAg检测标准曲线的制作,磁分离化学发光免疫法检测HBsAg的标准曲线,27,检测11份HBsAg阴性血清，根据IUPAC建议，计算得到本方法的检出限为8.610-4 ng/mL。,实验II,西北大学硕士研究生论文答辩,精密度试验,在线性范围内选取浓度为4 10-10 g/mL的HBsAg 标准品，重复测定11次，计算测定值的相对标准偏差 RSD = 6.8%。,28,
15、实验II,西北大学硕士研究生论文答辩,小 结,建立了以金磁微粒为载体的化学发光酶免疫分析定量检测HBsAg的方法。 建立了HBsAg含量与其相应的发光信号值之间的回归曲线，线性良好，R2 = 0.996，检测范围为4 1100 pg/mL。 该方法检测HBsAg的最低检出限为8.610-4 ng/mL，比目前商品化试剂盒（检出限通常为0.5 1 ng/mL）的灵敏性提高了1000倍。,29,全文总结,以金磁复合微粒作为固相载体，将乙肝病毒表面抗体包被于金磁微粒表面。建立了双抗体夹心ELISA检测HBsAg的方法。用标准HBsAg血清盘对本方法进行了验证，结果表明，方法的批内及批间相对标准偏差在
16、1.20 7%的范围；乙肝病毒表面抗原adw，adr，ay三种亚型的最低检出浓度分别为0.5 ng/ml，0.5 ng/ml及 1.0 ng/ml，其灵敏度与目前商品化ELISA试剂盒的检测结果相当；同时方法的精密性和特异性实验结果均符合HBsAg国家参考标准品的要求。,西北大学硕士研究生论文答辩,30,全文总结,以金磁复合微粒作为固相载体，并引入Luminol-H2O2-HRP化学发光体系，以对碘苯酚（PIP）作为化学发光反应的增强剂，建立了检测HBsAg的化学发光酶免疫分析法。在检测体系的最优条件下，建立了HBsAg的浓度与其相对发光光子数值之间的标准曲线，线性良好，R2 = 0.996，线性范围为4 1100 pg/mL，检测限为8.610-4 ng/mL，其灵敏度较一般ELISA法大大提高。,西北大学硕
