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1、四川省人民医院 乔宁,EVIDENCE,真菌感染与实验室诊断进展,真菌感染日趋增加, 患者年龄的增高 广谱抗生素的应用 更多、更复杂的医疗手段（如移植等） 高强度细胞毒性治疗的应用 免疫抑制剂的应用 其它病因死亡率相对降低,真菌是院内感染常见微生物,占院内感染的-7.5% 血液感染的-第四位 肿瘤病人发病率-为8% 严重创伤、烧伤病人-高达16% 死亡率高-达55%70%,真菌感染的流行病学概况,真菌感染的第一个变化：深部真菌感染上升，其中曲霉菌感染明显上升； 近20年真菌感染的第二个变化：白色假丝酵母菌比例减少，其他念珠菌的比例上升。 曲霉菌引起全身感染的病例已不罕见，死亡率增加。,真菌感染
2、的危险因素,基础疾病 广谱抗生素使用 静脉插管及各种侵袭性操作 肾上腺糖皮质激素、免疫抑制剂、放射性或化学治疗后、器官移植后 高龄（65岁）、婴幼儿 住院时间长，尤其是入住ICU大于5天以上,真菌概述,浅部真菌,深部真菌,双相型真菌,真菌感染的分类,根据真菌侵犯人体的部位分为四类： 浅表真菌病 皮肤真菌病 皮下组织真菌病 系统性真菌病,浅部真菌病,深部真菌病,临床常见的真菌病,浅表真菌病 花斑癣 掌黑癣 毛结节菌病,皮肤真菌病 皮肤癣菌病 手足、体股、头、甲 皮肤念珠菌病,皮下真菌病 孢子丝菌病 着色芽生菌病 暗色丝孢霉病 足菌肿,系统性真菌病 念珠菌病 曲霉病 隐球菌病 接合菌病 双相真菌感
3、染,浅部真菌病,限于皮肤最外层，甲板、毛发和粘膜的感染。 主要的感染是皮肤癣菌病和浅表念珠菌病。 大多轻微，容易诊断，对治疗反应良好。,手、足、甲癣最常见的真菌病,各种头癣：传染、危害健康,皮下真菌病往往经过外伤发病,孢子丝菌病,着色芽生菌病,系统性真菌病,常起源于肺，可以播散到全身许多器官,严重的可引 起死亡。 常通过吸入致病菌孢子而获得，其致病菌腐生于土壤或腐败有机物中，或作为植物致病菌。 病原体可分为两组：真正的致病菌和条件致病菌。,系统性真菌病危及生命,系统性真菌病主要的致病真菌,荚膜组织胞浆菌 粗球孢子菌 皮炎芽生菌 巴西副球孢子菌,临床常见的条件性真菌感染,念珠菌病: 最常见，血源
4、感染的第4位。 曲霉菌病: 常见于干细胞移植、实体器官移植、大剂量化疗患者。 隐球菌病: 艾滋病人患病率为10-20%。 接合菌病（毛霉病）:多见于重症糖尿病、烧伤病及器官移植病人。,临床有增多趋势的条件致病性真菌,非白念念珠菌感染 毛孢子菌感染 地霉感染 镰刀菌感染 枝顶孢霉感染 暗色真菌感染 马尔尼菲青霉,真菌感染的诊断方法,真菌镜检 真菌培养 组织病理 生理生化 血清学方法 分子生物学,真菌镜检,革兰染色 各种真菌均染成革兰阳性 直接镜检 氢氧化钾（KOH）标本 墨汁标本 隐球菌 其它染色(糖原染色、镀银染色、乳酸酚棉蓝染色等)，组织病理学,真菌直接镜检的操作,1.采集标本于载玻片上，滴
5、加10%KOH一滴 2.覆上盖玻片并微加热，略加压制片后作镜检 3.查见真菌的有形成分（菌丝、孢子）即为阳性，反之，则为阴性,真菌直接涂片的诊断价值,最重要又基本的检测方法，一般医院都能开展，能为临床提供及时的诊断依据。 发现真菌的有形成分如菌丝、假菌丝或较多的孢子往往提示真菌感染。 根据菌丝、孢子的形态，部分可确定病原菌 隐球菌：墨汁涂片中可见厚而透亮的荚膜 念珠菌：假菌丝及芽孢 马拉色菌：粗短如香蕉状的菌丝和圆形的孢子 毛霉菌：粗大而不分隔的菌丝,念珠菌病-直接镜检,隐球菌病直接镜检,新 型 隐 球 菌,组织病理学,阿申蓝染色,H&E,PAS,组织学特点,Immunochemistry,皮
6、肤隐球菌病的组织病理学,菌丝 孢子 曲霉病的 组织病理学,Prof. Richardd Calderones lecture-2006, Beijing,曲霉病,曲霉头,双分支菌丝,曲霉病直接镜检,双分支菌丝,曲霉头,接合菌（毛霉）病直接镜检,粗大无分隔菌丝,真菌的培养,培养特性： 营养要求不高，在 沙 保（Sabouraud）培养基上， PH46生长良好，需氧。 浅部真菌： 2228，生长缓慢，大多于12 周出现典型菌落。 深部感染真菌：37长的最好，生长较快，34 天即长出菌落。,真菌各种培养法,常用真菌培养基及用途,真菌的鉴定,方法： 生化反应:用于主要深部感染真菌如假丝酵母菌、隐球菌等
7、。 芽管形成 厚膜孢子生成 免疫学及分子生物学试验 镜检:丝状真菌,常见病原真菌,酵母及酵母样真菌 _念珠菌 _隐球菌 _毛孢子菌 _马拉色菌等,霉菌(丝状真菌) _皮肤癣菌 _曲霉菌 _毛霉菌 _镰刀菌等,双相真菌,念珠菌-实验室检查,直接镜检：可见卵园形发芽孢子及菌丝，如查到大量假菌丝，说明念珠菌处于致病状态。 染色：革兰染色，菌丝、芽孢呈蓝色，着色不均匀。过碘酸染色，菌丝、芽孢染成红色。用1:1000吖啶橙染色，在荧光显微镜下，菌体呈现荧光。 培养：最常用的培养基是沙保氏培基，当菌落生长后再移种至米粉吐温80培基或其它鉴定培养基中，以便进一步鉴定菌种。,芽管试验（Germ-tube te
8、st）,原理：白念珠菌在有营养的液体环境中35培养，可从酵母细胞生出芽管。 结果：白念珠菌可在2h内生成芽管，热带念珠菌和其他念珠菌则否。,厚膜孢子形成试验 （Dalmo plate test）,念珠菌显色培养基 CHROMagar Candida,APIAUX酵母鉴定系统,ID32C 酵母鉴定系统,隐球菌 (Cryptococcus),土壤、鸟粪、尤其是鸽粪中大量存在，它是机会致病菌。 本属的共同特征为细胞呈圆形或卵圆形，偶有伸长形或多样形，呈多边芽殖。 大部分菌株有荚膜。 通过呼吸道进入体内 健康人具有免疫能力 易感因素 AIDS、糖尿病、淋巴瘤、肿瘤、SLE、器官移植,隐球菌病crypt
9、ococcosis,实验室检查-病原学检查,直接镜检: 墨汁染色，新生隐球菌呈圆形的双层厚壁孢子, 外有一层宽阔荚膜, 边缘清楚完整, 菌体内可见出芽（菌体计数：判断预后及疗效的指标） 培养：培养基内可加氯霉素, 但不可加放线菌酮, 因后者抑制本菌生长。 生理生化测定：采用自动微生物系统和API鉴定 组织病理学检查及免疫组化,直接镜检,脑脊液直接墨汁涂片,真菌培养,SDA培养基，25培养,实验室检查-其它检查方法,乳胶凝集试验,阴性,阳性,隐球菌荚膜多糖抗原乳胶凝集试验,标本为脑脊液或血清 操作简便、快速，可用于隐球菌感染的早期诊断 灵敏度和特异性均在95%以上，且有估计预后和疗效的作用。,隐
10、球菌敏感药物,两性霉素B 5-氟胞嘧啶 (与两性霉素B联合用药) 氟康唑,曲霉菌-分类,烟曲霉是最常见的致病曲霉 其次为黄曲霉和黑曲霉 棒曲霉、灰绿曲霉、构巢曲霉、米曲霉、土曲霉、焦曲霉、杂色曲霉也有致病报道，但发生率低。,1、烟曲霉菌,在SDA培养基上菌落生长快，棉花样，开始为白色，23天后转为绿色，数日后变为深绿色，呈粉末状。分生孢子头的顶囊烧瓶状，小梗单层，排列成木栅状，布满顶囊表面3/4，顶端有链形分生孢子，分生孢子球形，有小棘，绿色。,2、黄曲霉菌,在SDA培养基上菌落生长快，黄色，表面粉末状。分生孢子头顶囊球形或近球形，小梗双层，第一层长，布满顶囊表面，呈放射状排列，黄色，顶端有链
11、形孢子,3、土曲霉菌,在SDA培养基上菌落生长快，小，圆形，淡褐色或褐色。分生孢子头的顶囊半球形，小梗双层，第一层短，第二层长，呈放射状排列，分布顶囊表面2/3，顶端有链形孢子 。,4、黑曲霉菌,在SDA培养基上菌落生长快，表面黑色，粉末状。分生孢子头的顶囊球形或近球形，小梗双层，第一层粗大，第二层短小，呈放射状排列，布满整个顶囊，黑色，顶端有链形孢子 。,5、杂色曲霉菌,在SDA培养基上菌落生长慢，菌落圆形紧密，绒毛状，羊毛状，颜色有数环，从青绿到红绿。分生孢子头的顶囊近球形，小梗双层，第一层长，第二层短，呈放射状排列，布满顶囊4/5，顶端有链形孢子,6、构巢曲霉菌,在SDA培养基上菌落暗绿
12、色，中央呈粉末状，边缘绒毛状。分生孢子头的顶囊半球形，小梗双层，第一层短，第二层长，呈放射状排列，布顶囊1/2，顶端有链形孢子。,曲霉菌的主要形态特征,菌丝-分隔、分枝、无色/淡色/深色 足细胞-有 分生孢子梗-分隔/不分隔,光滑/不光滑 顶囊-烧瓶/半球 产孢结构瓶梗/瓶梗+梗基 分生孢子大小、颜色、纹饰 其它:子囊果、菌核等,毛霉病(mucormycosis)概述,是由毛霉目中某些菌种引起人类一种感染性疾病, 一般呈急性快速发展, 少数为慢性发展。 可累及鼻、脑、肺、胃肠道、皮肤等器官，其共同特征是血管壁破坏，血栓形成，周围组织梗塞，产生黑色坏死性损害。 大部分病人有严重的基础疾病, 如糖
13、尿病、免疫抑制、饥饿、烧伤或其它严重的外伤。,诊 断,较困难, 特别是内脏器官感染, 常常是在尸检中发现。 毛霉为空气的污染菌, 血、尿、脑脊液中罕见病原体生长, 血清学试验和直接ELISA 试验缺乏特异性。 直接镜检标本中和组织病理切片中见到宽大无分隔或极少分隔菌丝, 比培养分离更有意义。真菌镜检阴性, 不能除外诊断。 糖尿病患者, 有急性快速播散的鼻窦炎、眶组织蜂窝织炎、支气管炎、支气管或叶的肺炎, 应考虑毛霉病的诊断。,毛霉菌的形态,直接镜检,可见粗大的、无分隔的、不规则、宽约3-18um、分枝较少且呈直角的菌丝 在HE染色清晰,PAS和GMS染色不良 发现菌丝是诊断的基础,毛霉菌的培养
14、,毛霉目中的致病菌在许多真菌培养基上快速生长 对放线菌酮敏感，故培养基内不用此药，可加抗生素抑制细菌生长。 活体标本不要研磨以免损坏菌丝，而妨碍生长。 置于2530培养，根据镜下特征鉴定菌种。,双相型真菌,37 C 酵母相,27 C 菌丝相,定义,专指那些在组织内或37培养时呈酵母相，于室温中培养时则呈菌丝相的致病真菌 包括申克孢子丝菌、马内菲青霉菌、荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌、巴西副球孢子菌和皮炎芽生菌等 有较严格的地域分布（仅申克孢子丝菌此点不突出） 对人体致病力较强（有较大的侵袭性），患者不一定在感染前有免疫受损,马内菲青霉 （Penicilium marneffei）,属于双相型真菌
15、可引起马内菲青霉病（penicilliosis marneffei） 主要流行区为东南亚，如泰国北部、越南、香港、台湾及中国的南方 目前已成为HIV阳性患者的主要条件致病菌,青霉菌菌落特征,菌丝相,酵母相,在SDA或PDA上，25培养，生长快，初为白色膜样或绒状，逐渐变为黄色至黄绿色绒状，2周后呈灰绿色粉状，能产生可溶性酒红色色素，培养基呈红色（霉菌相）,青霉菌菌落特征,37在SDA上培养3天（酵母相）,显微镜特征-菌丝相,帚状枝分散，双轮生，少数为单轮生，对称或不对称，有27个梗基，梗基上有36个瓶梗，顶端变窄，也可见单个瓶梗 分生孢子呈椭圆形、球形，长而散乱，不成束,显微镜特征酵母相,可见
16、关节孢子，圆形、椭圆形及两端钝圆有横隔的长形酵母细胞,非培养诊断的方法简介,真菌细胞壁成分 （1-3）- D-葡聚糖检测（G试验） 真菌抗原检查 半乳甘露聚糖（galactomannan) 抗原（GM) 甘露聚糖(mannan)抗原 隐球菌荚膜多糖抗原（乳胶凝集试验） 真菌特异的代谢产物（D-阿拉伯糖醇） 真菌DNA的检测,镜检和培养方法,敏感性低 血培养：在肿瘤和血液病病人中，50%尸检证实深部念珠菌感染的病例血培养阴性。 培养结果阳性仅表示存在某种真菌，区分定植 和感染困难 培养时间长 有些标本采集困难,非培养方法优点, 快速报告结果 敏感性提高 取材简便 多以真菌在致病状态产生的物质为检测标 志物，结果阳性提示有致病性 定量检测可判断感染严重程度及疗效评估,
