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1、Biochemistry 生物化学,第4章 蛋白质的共价结构,一、蛋白质通论 二、肽 三、蛋白质一级结构的测定 四、蛋白质的氨基酸序列与生物功能 五、肽和蛋白质的人工合成,(Covalent structure of protein),一、蛋白质通论,蛋白质的化学组成,碳50% 氢7% 氧23% 氮16% 硫03% 其它（P、Fe、Cu、I、Zn、 Mo、Mn、Ca等）,定氮法测定蛋白质含量,氮为蛋白质的特征元素，将提取并纯化的蛋白质用凯氏定氮法测定氮的含量，然后通过下列公式可以计算蛋白质的含量： 蛋白质含量（mg/ml）= 蛋白氮（mg/ml）6.25 （或 = 蛋白氮（mg/ml）16%）
2、,蛋白质的分类,仅由氨基酸缩合而成，不含其它成分的蛋白质叫单纯蛋白质（simple protein）；还含有其它成分的蛋白质叫缀合蛋白质（conjugated protein），缀合蛋白质中的非蛋白质成分叫配体（ligand），有些配体与蛋白质通过共价键结合，有些通过非共价键结合。,蛋白质的分类,蛋白质还可以： 按溶解性质分类（见P158表4-1） 按所含配体种类分类（见P158表4-2） 按生物学功能分类（见P158表4-3）,蛋白质的形状,纤维状蛋白质 球状蛋白质 膜结合蛋白质,Collagen Myoglobin Bacteriorhodopsin,蛋白质的大小,蛋白质的大小,蛋白质的分
3、子量很大，并且分布范围也很大，一般在大约6000110 6 道尔顿。蛋白质的分子量主要由组成蛋白质的氨基酸残基的数目决定，对于缀合蛋白质来说，有些配体也在蛋白质的分子量中占有很大的比重。蛋白质的分子量范围是人为规定的，更小的氨基酸缩合物叫做肽。,蛋白质氨基酸残基数的估计,对于简单蛋白质，用110除它的相对分子量即可约略估计出其氨基酸残基数目。 20种常见氨基酸的平均分子量为138 组成蛋白质的氨基酸的平均分子量为128 每个氨基酸残基的平均分子量为110,蛋白质结构的组织层次,一级结构指的是多肽链的氨基酸序列 二级结构指的是多肽链借助于氢键排列成有规律的、局部的结构 三级结构是指多肽链借助各种
4、非共价键弯曲、折叠成具有特定走向的紧密球状构象 四级结构指的是寡聚蛋白质亚基间的结合，亚基间不同的排列方式会形成不同的构象。,Lys-Cys-Phe-Ala-Ile-Glu-Cys-Leu ,蛋白质的一级结构,SS,N端,C端,蛋白质的二级结构,“Shorthand”-helix “Shorthand”-strand,蛋白质的三级结构,Chymotrypsin space-filling model Chymotrypsin ribbon,蛋白质的四级结构,蛋白质的一级结构 决定高级结构,在肽链内或肽链间有时也有 两个半胱氨酸之间形成二硫键的连接。,蛋白质功能的多样性,1催化； 2调节； 3转
5、运； 4贮存； 5运动； 6结构成分； 7支架作用； 8防御和进攻； 9异常功能。,二、肽,肽的命名,肽是两个至数百个氨基酸之间由肽键连接而成的线状聚合物。根据形成肽的氨基酸数目，一般氨基酸数目在12个以内时，称为二肽、三肽、四肽等；13个至20个时称为寡肽（oligopeptide）；20个以上称为多肽（polypeptide）。当分子量大到一定程度时，就称为蛋白质。寡肽和多肽的区分完全是人为规定的，其间的界限并不严格。 肽链中的氨基酸因缺少了一分子水，叫做氨基酸残基。,肽的两端,一条肽链是有方向性的，肽链的一端具有游离的氨基，称其为N端；另一端具有游离的羧基，称其为C端。有少数小分子量的肽
6、，其首尾也缩合成肽键，成为环肽。,肽的命名,对于小分子量的肽的命名，是从其N端开始，称为某氨酰某氨酰某氨酰某氨基酸，下例写成Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu，左边是N端，右边是C端。,肽的命名,对于生物体内的具有特定结构和功能的小分子量肽，还有特别名称，如脑啡肽、内啡肽、催产素、加压素等。,肽基的C、O和N原子间的共振相互作用,肽键共振的结果, 限制肽键的自由旋转，给肽主链的每一个氨基酸残基只保留两个自由度。 组成肽基的4个原子和2个相邻的C原子倾,向于共平面，形成所谓的多肽主链的酰胺平面（amide plane）或称肽平面（peptide plane）。,肽平面,肽键共振的结果, CN
7、 键的长度为0.133nm，比正常的 CN 单键（0.145nm）短，但比典型的 C=N 键（0.125nm）长。估计肽基中的 CN 键具有约40%的双键性质，而 C=O 键具有40%的单键性质，在室温下足以防止 CN 键旋转。 杂化的中间态酰胺带有0.28个净正电荷，羰基带有0.28个净负电荷，肽键具有永久偶极。,肽基的顺、反构型,肽平面内，两个C可以处于顺式或反式构型。因为顺式构型两个R基有空间位阻，所以反式构型比顺式构型稳定，因此肽链中肽键几乎都是反式构型。,脯氨酸的亚氨基形成的肽键,Of the peptide bonds between amino acid residues oth
8、er than Pro, over 99.95% are in the trans configuration. For peptide bonds involving the imino nitrogen of proline, however, about 6% are in the cis configuration; many of these occur at turns.,trans cis,肽的物理化学性质,由于短肽晶体的熔点都很高，说明短肽的晶体是离子晶格，在水溶液中以偶极离子存在。 在pH014范围内，肽键中的酰胺氢不解离，所以肽的酸碱性主要决定于肽链末端的羧基、氨基以及R基
9、团上的可解离基团。 因为肽链末端的羧基和氨基相距很远，它们之间的静电引力较弱，所以它们的酸碱性比氨基酸的羧基和氨基弱。R基上可解离基团的解离常数也有所变化。 在某一pH下，肽中各可解离基团解离得到的净电荷为0，这个pH就是该肽的等电点。,肽的物理化学性质,肽的化学反应和氨基酸的一致。N端的氨基酸残基也可以与茚三酮反应，这一反应可用于肽的定性和定量测定。 双缩脲反应是肽和蛋白质特有的，氨基酸没有此反应。一般含有两个或两个以上肽键的化合物与CuSO4碱性溶液都能发生双缩脲反应，生成紫红色或蓝紫色的复合物，利用这个反应可以用分光光度法（540nm）测定蛋白质的含量。,双缩脲与肽的结构比较,双缩脲,三
10、肽,三、蛋白质一级结构的测定,蛋白质测序的策略,首先要得到较纯的蛋白质样品，纯度应在97%以上。 测出它的分子量。 分析蛋白质中是否有非肽成分。 测定蛋白质分子中的多肽链的数目。 拆分多肽链。 测定肽链的氨基酸组成。 鉴定肽链的C末端氨基酸及N末端氨基酸。,蛋白质测序的策略,酶水解肽链成短的肽段。采用两套以上的酶水解方法，得到互相重叠的肽段。分离纯化这些肽段，并鉴定各肽段的C末端氨基酸及N末端氨基酸。 测定各肽段的序列。 确定天冬酰胺、谷氨酰胺以及链内或链间二硫键的位置。 拼出完整肽链的序列。,N末端分析,二硝基氟苯法（DNFB法）：用DNFB（Sanger试剂）与肽链N末端的氨基反应，生成D
11、NP多肽或DNP蛋白质。然后水解肽链，分离得到DNP氨基酸，纸层析、薄层层析或HPLC分离鉴定。 丹磺酰氯法（DNS法）：与DNFB法类似，由于丹磺酰氯有强烈荧光，灵敏度比DNFB法高100倍。,DNP-氨基酸,N末端分析,苯异硫氰酸酯法（Edman降解法）：肽链与PITC（Edman试剂）反应生成PTC多肽（苯氨基硫甲酰多肽）或PTC蛋白质，在酸性有机溶剂中加热时，N末端的PTC氨基酸发生环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物（PTH氨基酸）并从肽链上脱落下来，除去N末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的。分离PTH氨基酸并鉴定。肽链可用于鉴定下一个氨基酸，所以此法可以用于测序。 氨肽酶法：根据游离氨基
12、酸出现的时间顺序分析N末端氨基酸。值得注意是不同的N末端氨基酸水解的速度不同，有时难以分析。,PTH-氨基酸,C末端分析,肼解法：蛋白质或多肽与无水肼加热发生肼解。反应中除C末端氨基酸以游离形式存在外，其它氨基酸都转变成相应的氨基酸酰肼。反应中生成的氨基酸酰肼可与苯甲醛作用变成水不溶性的二苯基衍生物而沉淀。上清液中游离的C末端氨基酸借助DNFB法或DNS法鉴定。肼解过程中，天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸被破坏不易测出，精氨酸转变成鸟氨酸。,肼解法反应式,C末端分析,还原法：肽链C末端的氨基酸可用硼氢化锂还原成相应的氨基醇，肽链水解后层析鉴定。,C末端分析,羧肽酶法：目前常用的有4种羧肽酶：A、B
13、、C和Y。羧肽酶A能释放除Pro、Arg和Lys之外的任何一种C末端氨基酸；羧肽酶B只能水解以碱性氨基酸Arg和Lys为C末端的氨基酸；羧肽酶C和Y可以释放任何一种C末端氨基酸。,-Val-Ser-Gly,二硫桥的断裂,先加8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍使蛋白质变性，再用氧化法或还原法断裂二硫键。还原法产生的巯基要用烷基化试剂如碘乙酸保护起来，以免重新形成二硫键。,碘乙酸保护,还原法断裂二硫桥,氧化法断裂二硫桥,过甲酸,氨基酸组成的分析,酸水解分析除色氨酸外的其它氨基酸，碱水解分析色氨酸。 为了准确分析酸水解中被部分破坏的Ser、Thr、Tyr、Cys的量，酸水解24、48、72小时后，
14、分析这些氨基酸的量，然后外推至0时得到这些氨基酸不被破坏时的量。 分析酸水解液中NH3的量，得出有多少个Asn + Gln。 氨基酸的分析：离子交换柱层析分离，茚三酮染色，比色定量。,某些氨基酸含量 随水解时间的变化,易被破坏的氨基酸采用外推法测定,疏水氨基酸难以水解，采用极限法测定,氨基酸分析仪示意图,加热,氨基酸分析仪示意图,长柱用于分离酸性和中性氨基酸,短柱用于分离碱性氨基酸和氨,柱中填料为细粒聚苯乙烯磺酸型阳离子交换树脂,氨基酸的离子交换柱层析图谱,洗脱曲线,多肽链的部分裂解,酶裂解法：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、葡萄球菌蛋白酶、梭菌蛋白酶等
15、，它们各自有自己的水解专一性。蛋白酶分为内肽酶和外肽酶（羧肽酶、氨肽酶）。 化学裂解法：溴化氰（只裂解由Met的羧基形成的肽键）、羟胺（裂解Asn-Gly之间的肽键，也能部分裂解Asn-Leu及Asn-Ala之间的肽键）。,蛋白酶的专一性,AECys,溴化氰裂解法,溴化氰只裂解由Met的羧基形成的肽键,肽段的分离纯化,凝胶过滤 凝胶电泳 高效液相色谱,氨基酸序列测定,质谱法：两台质谱仪联用，第一台质谱仪通过电喷射电离使肽段带上电荷，将不同大小的肽段分离。第二台质谱仪分析肽段的序列。在第二台质谱仪上，小肽段在碰撞池中与氮气分子或氩气分子碰撞，碎裂成依次少一个氨基酸残基的碎片，分析这些碎片的质量差，可得出序列。,串联质谱仪,串联质谱测序工作原理,分离肽段,测序,氨基酸序列测定,Edman降解法：由N端向C端逐步降解。先将被测肽段的羧基端固定到不溶性的树脂上，便于分离切下的氨基酸和剩余的肽段。 酶降解法：用外肽酶逐个切下氨基酸分析。只能分析很少的几个氨基酸。 根据核苷酸序列的推定法：找到该蛋白质的基因，从基因的编码序列按三联密码推出氨基酸序列。,所得资料：N-末端残基 H C-末端残基S 第一套肽段 第二套肽段 OUS SEO PS WTOU EOVE VERL RLA APS HOWT
