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1、临床生物化学检验基础,用户服务部华北区检验临床,主要内容,生 化 检 验 的 概 述,生 化 检 验 的 对 象,生 化 检 验 的 作 用,生 化 检 验 的 手 段,临床生化检验：主要是运用物理学、化 学、生物学等实验室技术和方法，通过感官、 试剂反应、仪器分析和动物实验等手段，对 病人的血液、体液、分泌液、排泄物等标本 进行检验，以获得反映机体功能状态、病理 变化或病因等的客观资料。,概 述,标本种类： 血液 尿液 脑脊液 胸腹水 精液,对 象,胃液 十二指肠液 羊水 唾液 汗液 组织液,血 液 的 组 成,血 液,标 本 的 采 集,标 本 的 处 理,标本的运输和保存,血液的组成,血
2、液由血细胞和血浆组成的红色粘稠混悬液。,血细胞：4550 血 浆：5055 水分：9192 蛋白质 有机物 无机盐 代谢产物,血液的组成,血液标本类型： 全血：离体血液立即与适量抗凝剂混合， 轻轻混匀，则可避免凝固，从而 得到抗凝全血。 血浆：将抗凝全血在一定条件下将其离 心沉淀后的上层浅黄色的液体。 血清：离体血液自行凝固收缩析出淡黄 色透明的液体。,血清和血浆的区别： 血清中缺少了凝血系统中的某些凝血因子（凝血过程中被消耗）如凝血因子（纤维蛋白原）、凝血因子（凝血酶原）、凝血因子（易变因子）、凝血因子（抗血友病球蛋白AHG）等。,血液的组成,血清与肝素血浆的差异（一）,总蛋白 白蛋白 TS
3、H 转铁蛋白 AST 肌酸激酶 总胆红素 钠 铁 胆碱酯酶 碱性磷酸酶 直接胆红素 甘油三酯 LDH 无机磷 钾 GGT 三碘甲状腺素 乳酸,血清与肝素血浆的差异（二）,标本的采集,采血方法： 毛细血管法：血球计数仪、微量分析等。 静脉采血法：生化检验常用，真实反应。 动脉采血法：个别特殊检验，血气分析 注意:生化分析仪测量CO2问题,标本的采集,静脉采血法注意事项：,抽血姿势 抽血时间 饮食 运动,溶血 脂血 药物,标本的采集,溶血：必须避免 （1）注射器和容器不干燥、不清洁； （2）压脉带捆扎时间太长，淤血过久； （3）穿刺不顺损伤组织过多； （4）抽血速度太快； （5）血液注入容器时未取
4、下针头或用力推 出产生大量气泡； （6）抗凝血用力振荡； （7）全血放置时间过久； （8）离心机速度过快。,标本的处理,抗凝剂： 枸橼酸钠：出凝血疾病检验和ESR； 草酸钠：出凝血疾病检验； 乙二酸四乙酸盐：EDTA-K2/Na2，血RT； 双草酸盐：草酸钾（钠）/草酸铵，Ht等； 氟化钠：适于血糖，抑制糖酵解、血清酶； 肝素：多种生化分析，临床常用抗血栓药 对部分生化项目有影响；,标本的处理,分离： 用离心机在符合要求的转速下离心10min得到生化标本； 转速选择：RCF1.118L（r/1000）2 RCF：相对离心力，在生化检验分析中的 标本相对离心力在15001800； L：离心半径，
5、以mm计算，即离心管至旋 转轴中心距离； r：转子每分钟转速。,分离注意事项： 转速不够，离心不彻底，不能很好的将血清分离，在血清中容易夹杂纤维蛋白，在测试过程中容易堵针，影响测试。 转速过高，容易造成溶血。 例：10cm离心半径的离心机，我们要得到生化分析的合格标本，应选择36624012之间转速，离心10min即可。,标本的处理,标本的运输和保存,运输： 分离出的血清或血浆，运送过程中注意容器的密闭性、注意避光、避免剧烈震荡。 保存： 不能及时检测或需保留以备复查时，一般密闭存放于410冰箱中，以免水分蒸发造成标本浓缩或细胞内外交换影响结果。,手 段,检 测 仪 器,检 测 试 剂,检 测
6、 方 法,操 作 人 员,校 准 品,检 测 仪 器,生化分析仪： 进行设置参数、试剂位置、定标测试、质控测试后就可以上机测试标本。 。 保证生化结果准确性的因素除包括样本质量外还包括整个检测系统的工作状态，检测系统的工作状态保持最佳，除了保证仪器所在实验室的环境，仪器参数的正确编制，配套校准品试剂的使用、定期校正、定期保养等都是保证检测质量的重要方面。,检 测 试 剂,试剂的分类： 干粉试剂：易保存、便宜， 复溶瓶间差大，效期短，浪费； 液体试剂：稳定性好，效期长，浪费少； 双 试 剂：消除干扰物影响；,试剂指示系统和化学原理,NAD+NADH(NADP+NADPH ),p-NP和p-NA,
7、H2O2偶联,其它显色系统,抗原抗体反应,检 测 试 剂,NAD+NADH(NADP+NADPH )指示系统 ： NADH和NADPH在340nm有最大吸收峰，而NAD+和NADP+在340nm无吸收峰，利用其偶联的脱氢酶(工具酶)反应，根据340nm吸光度的变化，可以测定物质的浓度或活性。 目前利用此指示系统进行测定的临床项目有：ALT、AST、CK、LDH、CK-MB、-HBDH 、Glu（己糖激酶法）、UREA、NH4+ 、CO2等。,NAD+NADH(NADP+NADPH )指示系统 ： ALT为例： R1： NADH 、乳酸脱氢酶（LDH） R2： L-丙氨酸 、-酮戊二酸 ALT
8、L-丙氨酸 +-酮戊二酸 丙酮酸 + L-谷氨酸 LDH 丙酮酸 + NADH + H+ L-乳酸 + NAD+ + H2O,检 测 试 剂,p-NP和p-NA指示系统 ： p-NP和p-NA在405nm有特征性吸收峰，根据405nm吸光度的变化，可以测定物质的浓度或活性。 目前利用此指示系统进行测定的临床项目有ALP、r-GT、AMY等。,检 测 试 剂,p-NP和p-NA指示系统 ： ALP为例： R1：AMP缓冲液 、MgCl2 R2：对硝基苯磷酸盐 ALP 对硝基苯磷酸盐+H2O 磷酸盐+对硝基苯酚,检 测 试 剂,检 测 试 剂,H2O2偶联的指示系统 ： H2O2在过氧化物酶的作用
9、下，可使单一个或成对的无色的色素原氧化成有色的色素，导致某一波长吸光度的增加，因此可用来测定物质的浓度或活性。 目前利用此指示系统进行测定的临床项目有TC、TG、HDL-C、LDL-C、Glu（氧化酶法 ）、Cr、UA等。,检 测 试 剂,H2O2偶联的指示系统 ： GLU为例： R1：4-氨基安替吡啉 、抗坏血酸氧化酶 R2：葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、酚 。 GOD 葡萄糖 + O2 + H2O 葡萄糖酸 + H2O2 POD 2H2O2 + 4-氨基安替吡啉+酚 醌亚胺 + 4H2O,检 测 试 剂,抗原抗体反应指示系统 ： 特异性抗体与抗原(待测物质)在相应的缓冲环境下反应生成抗原抗体复
10、合物，形成一定的浊度，导致特定波长透光率的改变。在抗体过剩的前提下，改变程度与抗原浓度成正比。 目前利用此指示系统进行测定的临床项目有apoAI、apoB、Lp(a)、IgG、IgA、IgM、C3、C4、CRP等。,检 测 试 剂,抗原抗体反应指示系统 ： 载脂蛋白为例： R1：磷酸盐缓冲液pH7.5,表面活性剂，防腐剂， 稳定剂； R2：羊抗人apo Al（apo B）抗血清，防腐剂， 稳定剂 。 抗原(血清中apo Al,apo B)+抗体(R2) 缓冲环境 抗原抗体免疫复合物。,检 测 试 剂,其他显色反应 ： TP为例： 蛋白质中的肽键在碱性溶液中与铜离子作用产生紫红色络合物，导致54
11、0nm吸光度的增加，增加程度与蛋白质的含量成正比。 碱性条件 肽键 + Cu2+ 紫红色络合物,检 测 试 剂,试剂使用注意事项： 干粉试剂在干粉状态下保存时间长，复溶后一般不超过3天； 配成“工作液”后保存时间很短，一般12天； 双试剂不能擅自改成“工作液”。,检 测 试 剂,试剂失效的判定方法： 通过试剂空白吸光度、颜色、PH值、查看反应曲线等来判断。 通过观看以往的正常反应曲线很重要；试剂空白吸光度在试剂说明书中说明，如AST、ALT，通常应在1.5A以上等,试剂线性范围： 生化试剂线性范围是指测试结果与反应度R成线性的范围，根据试剂说明书给定输入。 生化试剂线性范围实际上是指该试剂所能
12、检测到的样本最高浓度。 当出现超出线性范围时，应对样本进行稀释后重新测量。,检 测 试 剂,常用生化项目按化学性质分类： 酶 类 底物代谢类 无机离子类 特种蛋白类,检 测 试 剂,常用生化项目按临床性质分类： 肝功能 肾功能 血糖 血脂 心肌酶谱,检 测 试 剂,胰腺炎 无机离子 痛风 中毒,前列腺疾病 免疫性疾病 免疫炎症反应,常见生化项目之间的关系： GLOTPALB A/GALB/GLO O/PAST/ALT I-BILT-BILD-BIL A/BApoA/ApoB CK-MMCKCK-MB LDL-CT-CHOHDL-CTG/5（重量单位） T-CHOHDL-CTG/2.2（法定单位
13、） AGNaClHCO3 NaKClHCO3,检 测 试 剂,检 测 方 法,生化基本原理： Lambert-Beer定律，即吸光度与溶液的浓度和液层的厚度的乘积成正比。 A=-LogT=-Log(It/I0)= CL 当溶液液层的厚度L，光的波长和其它条件均固定不变，则所得的吸光度与溶液中有色物质的浓度成正比： A=kC，kL,方法： 吸收光谱法：比色分析基于溶液对光的选择性吸收而建立起来的一种分析方法。 比浊法：通过监测物质对光的散射透射强度来测定的方法，比浊法是一种浊度测定，而不是比色测定。,检 测 方 法,吸收光谱法： 终点法 一点终点法 二点终点法 动力学法（零级动力学法） 固定时间
14、法（一级动力学法）,检 测 方 法,终点法： 一点终点法公式： C样本(A样本A试剂空白/A标准A试剂空白)C标准 FC标准/（A标准A试剂空白） C样本（A样本A试剂空白）F 反应度计算：R A样本A试剂空白,检 测 方 法,终点法： 二点终点法（样本空白法）公式： C样本(A样本A样本空白/A标准A标准空白)C标准 FC标准/（A标准A标准空白） C样本（A样本A样本空白）F 反应度计算：R A样本A样本空白,检 测 方 法,动力学法： 因数法：A样本A样本A试剂空白 C样本（A样本/min）F A样本/min：每分钟样本吸光度变化率 反应度计算：,检 测 方 法,动力学法： 摩尔消光系数
15、法 ：,C样本,A样本/minVt1000,VSd,F,Vt1000,Vsd,1000,d,(1+,),VR,VS,：摩尔消光系数 d:比色杯光径（cm） Vt：总反应量 VS：样品量 VR：试剂量,检 测 方 法,固定时间法： 固定时间法公式：AAt4At3 C样本( A样本/ A标准)C标准 FC标准/ A标准 C样本 A样本F 反应度计算： R（At4At3）/（t4t3）,检 测 方 法,检 测 方 法,比浊法： 免疫比浊法： 免疫透射比浊法：是在光源的光路方向 测量透射强度，用终 点法测量。 用于血清特种蛋白的检测。 免疫散射比浊法： 常用于血凝仪中。 化学比浊法,校 准 品,定标：
16、浓度和反应度关系，找K值。 KC标准/（A标准A试剂空白） 决定因素： 1、标准液浓度，最好是血清基质，否则 可能会因为基质效应而影响定标效果。 2、标准液吸光度与试剂空白吸光度要准 确。吸光度受仪器状况、试剂状况的影响， 如果您的仪器相当稳定，试剂 是影响K值的一个主要因素。,何时定标？ 更换试剂厂家； 同一试剂厂家但更换批号； 试剂过长时间使用。,校 准 品,校 准 品,定标方法： 线性定标 单点线性 两点线性 多点线性 非线性定标 SPline Logistic-Log 4P Logistic-Log 5P Exponential5P,校 准 品,单点线性：,校 准 品,两点线性：,校 准 品,Logist
