hiv感染的实验诊断课件

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1、HIV感染的实验诊断,白立石 北京市疾病预防控制中心 艾滋病确认中心 2008年5月,一、HIV感染后的免疫和病毒学,HIV的基因组结构和蛋白,基质 衣壳 核衣壳 表面糖蛋白 跨膜糖蛋白,蛋白酶 反转录酶 整合酶,HIV结构基因,有3个 env(核苷酸5781-8360)编码包膜蛋白p160、120、41等。 gag(核苷酸310-1860)编码病毒核心/衣壳蛋白p55、24、15、17； pol(核苷酸1629-4673)编码逆转录酶(RT)、p66、51、32、11等；,HIV调节基因,有6个 tat:上调mRNA,促病毒复制-启动 rev:调节病毒mRNA-开关 vif:增强出芽,释放新

2、病毒颗粒-感染因子 nef:下调mRNA,抑病毒复制-制动 vpu:仅见于HIV-1,功能不详； vpx:仅见于HIV-2,功能不详。,5 days, Image from: Kahn and Walker, M.D. NEJM 1998, Volume 339:33-39 July 2,感染HIV后的血清学变化,HIV RNA,浓度,p24Ag,P24 Ag,Anti-gp41,120,160,Anti-p24,55,感染,1周 2周 6周 12周 810 年,急性期,潜伏期,艾滋病期,检出线,HIV-1早期感染病毒标志物的动态观察,窗口期,血浆RNA,P24,前病毒 DNA,HIV抗体:E

3、LISA,HIV抗体:WB,HIV感染者的三种临床转归,Virus,CD4,CD8 aHIV,CD4,CD4,CD8,CD8 aHIV,Virus,Virus,典型 810 y,快速 : 4-5 y : (2%),缓慢/长期不进展 : 10 y : (2%),二、HIV酶联筛查检测方法和试剂,感染急性期 ， 窗口期 检测试剂以ELISA为主，还有PA，斑点免疫胶体金和免疫层析。 ELISA试剂为HIV1/2型，包括M和O组，N组不包括但很少。 三四五代酶联试剂的差异和使用策略： 三代成熟质量稳定，窗口期20d;四代提前49d，质量不稳定，用于血站急性感染的检测。 筛查试验和确认试验的差异： 酶

4、联试验敏感性高于确认试验，四代试剂敏感性更高，确认阴性的不一定是真阴性。,（一）HIV抗体ELISA检测试剂（血液）,第三代：双抗原夹心法，可检测所有类型抗体，由于能检出IgM抗体，缩短了窗口期，有报道说较第二代产品平均可提前5天作出诊断。 第四代：双抗原（抗体）夹心法，将HIV P24抗体和HIV抗原同时包被，再加入待检血清，最后加入酶标记的HIV抗原和HIV P24单克隆抗体，同时检测血清中的HIV P24抗原和HIV抗体。 第五代：HIV抗体和P24抗原实现分别检测，真正实现早期诊断。,Fourth Generation,Third Generation,Second Generatio

5、n,IgM,IgG,各种HIV检测方法平均窗口期,方法 平均天数 第2代EIA 45 第3代EIA 22 P24抗原 16 HIV RNA 11,（二）、检测试剂的质量指标 灵敏度 诊断试验的灵敏度有两个不同意义： 1代表一个试验能检测最少量被分析物（如抗体）的能力。通常可对阳性血清进行稀释以确认哪个试验更敏感。 2指某试验检出阳性的能力（无假阴性）。一个试验有可能检出很少量的某抗体，但也可因试验中缺少适当的抗原而漏掉一些阳性样品。,2特异性 指某试验正确鉴定所有阴性的能力（无假阳性）。大部分HIV筛查试验不是100%特异，可用公式计算 真阴性 特异度= 100% 真阴性+假阳性 注：公式中真

6、阴性指试验中所能检测的真阴性数。 如100份血清，5份真阳性，95份真阴性，与参考试验比较，某试验检出6份阳性（一份假阳性），则 特异性=94/(94+1)100%=98.9%,3试验效率 指某试验正确鉴定所有阳性和阴性的总体能力（无假阳性 或假阴性），是灵敏度和特异性的综合指标，反映了该试验的 总的效率。 真阳性+真阴性 试验效率= 100% 真阳性+假阳性+真阴性+假阴性 注: 公式中真阳性和真阴性指试验数目。 在以上例子中，检测100份血清，5份真阳性，95份真阴 性，1份假阳性，1份假阴性，因此 4+94 试验效率= 100%=98% 4+1+94+1,4预测值 预测值与以上的参数不同

7、，它描述的是考虑了被检人群 中感染的流行因素后的试验评价。 阳性预测值（PPV）：定义为在所有阳性结果人群中感染 个体所占比例。 阴性预测值（NPV）：定义为在所有阴性结果人群中未感 染个体所占比例。 真阳性 阳性预测值= 100% 真阳性+假阳性 真阴性 阴性预测值= 100% 真阴性+假阴性 注：公式中真阳性和真阴性指试验数目。,在感染流行率较高（5%）的人群中 1000人受检：50份真阳性（已感染），950份真阴性（未感染）， 5份假阳性（试验结果），5份假阴性（试验结果），计算 PPV=45/(45+5)100%=90% NPV =945/(945+5)100%=99.5% 在另一人群

8、有相同的结果（即相同数量的假阳性和假阴性）,在感染流行率较低的人群（0.7%）中 1000人受检：7份真阳性（已感染），993份真阴性（未感染）， 5份假阳性（试验结果），5份假阴性（试验结果），计算 PPV=2 /2+5=28.6% NPV =988/988+5=99.5%,5艾滋病病原诊断中的几个问题 明确不同实验方法的意义和适应范围： HIV血清学检测方法可分初筛和确证两类。HIV初筛试验 特异性不够强，有时会造成一些假阳性结果，故在初筛试 验出现阳性结果时，应再重复试验，若仍为阳性再用确证 试验（West Blot）去证实。 但一些非感染者的血液也会对某些抗原显示反应（出现的条 带不够

9、判为阳性的标准），在正常的非感染者人群中发生比例15%，所以如果用WB来测ELISA阴性者的血清，有些标本被视为不确定。出现不确定结果时，可能是HIV早期感染或是非特异反应，应在1-6个月后复查，并结合个体的临床表现、感染因素、WB带型等综合分析后做出结论。,针对HIV感染不同时期选用不同的检测手段：HIV感染后两周内，无法查到抗体。两周后出现病毒血症，可用P24抗原检测方法或测逆转录酶活性。6-8周后抗体产生时，进行抗体检测。 诊断HIV感染在早期可检测抗原，而在感染后的大多数时间，可用血清学方法诊断。, HIV抗体测定的预测值：试剂的敏感性和特异性可衡量优劣，但不能完全决定一个测定结果正确

10、与否的可能性大小，与预测值关系更大。 預測值除与试剂好坏有关外，还取决于测定对象本身患病率的高低。由表1可以看出：在用ELISA法对高危人群检测时，其阳性预测值为99.98%，而在非高危人群中，阳性预测值仅为18.94%（即查出阳性结果是真阳性的机率只有18.94%），反之阴性结果的机率为99.997%。,表1 ELISA法HIV1抗体测定的预示值, HIV抗体检测反应强度与HIV感染的概率：ELISA法可根据光密度（OD）值的强度直接确定。反应越强的血清，含有HIV抗体的可能性就越大。表2中正常献血员（感染率30/10万），中等强度反应时，HIV抗体阳性概率仅为1%，高强度反应时，则为86.

11、1%。见表2。 不仅要看阴阳结果，还要看反应强度或S/CO比值。,表2 HIV感染机率与ELISA反应强度的关系,注： 1、数字表示相应强度反应的血清中含有HIV抗体的概率 2、低度为S/CO6。,三、确认试验,WB为主，还有：线性免疫试验（LIA）,放射免疫沉淀试验（RIPA）和免疫荧光试验（IFA）。 WB存有培养病毒的宿主细胞成分，容易出现非特异性反应造成不确定结果，LIA使用重组蛋白（多肽），非特异性大大减少，试剂盒有INNO-LIA,Pepti-Lav等。IFA很少使用。,（一）、HIV抗体强度与抗体带型的关系,（二）、HIV病毒载量与抗体带型的关系,（三）、造成WB假阳性或不确定的

12、原因,1.实验室操作中，阴性样本被污染或洗涤不彻底。 2.HIV感染急性期，窗口期附近，仅显示gp160或120，或P24，P31，P55带；此时ELISA往往已显示阳性反应 3.晚期AIDS病人，部分抗体如P24，P31丢失 4.其他病毒感染的交叉反应，如风疹，麻疹，腮腺炎等 5.自身免疫病，高丙种球蛋白血症（全身性红斑狼疮） 6.肾衰竭和血透析 7.遗传性胰腺囊肿 8.多次怀孕或输血 9. 肝病 10.乙肝、狂犬等疫苗注射，使用胸腺肽。 11.线粒体核酸和T细胞白细胞抗原引起的抗体,在无高危行为的献血和孕妇人群中， WB不确定率10-15%，甚至高达32. Gag蛋白抗体条带最常见。 EL

13、ISA筛查阳性结果中，WB不确定占4-20%,俄罗斯报告占12.7%。 我国，125份确认为HIV-1抗体阳性;条带出现百分率为：gp160、p24为100%, gp120、gp41、p66、p51和p31在96%以上, p17、p55分别为86.4%和85.6%. 上海，36例WB试验 gp120和 p24双阳性者的跟踪随访和核酸辅助诊断发现，至少24例可判定为HIV-1感染。5例样本的核酸测定结果与血清学随访检测结果的符合率达到100%。25例随访到的对象中，18例样本平均17 天后条带有明显进展，可以判定为HIV抗体阳转 。,（四）WB不确定结果的有关数据,（五）假阴性结果,指EIA+W

14、B的假阴性 原因 急性感染后的抗体迟反应 不同HIV毒株型 发病晚期抗体消失 窗口期：几周到6个月，与当地HIV流行率有关 HIV亚型，M/N/O组间差异,（六）、确认试验不确定标本的常规处理,按照全国艾滋病检测技术规范（2004年版）的要求，只能作“3个月后复检”的处理，三个月后复检1次，连续2次，共6个月。 其转归有两种可能：仍呈现不确定或阴性，则诊断为HIV抗体阴性；带型发生进展，符合HIV抗体阳性判断标准，则诊断为HIV抗体阳性。后者是真正的窗口期感染者（一般为2-3个月，最长6个月） ，只占很小的比例；大多数为非感染者，但由于WB反应的敏感性而出现条带。 如有必要，可用辅助诊断方法对

15、不确定样本进行实验诊断。,确认结果不确定标本的辅助诊断,1、病毒载量：RT-PCR,NASBA,b-DNA，高拷贝的结果提示感染。小于18个月婴儿在10000拷贝/毫升应做HIV感染处理。注意不同方法间结果的差异，阴性不排除感染。 2、免疫标志物：CD4/CD8, CTL,微球蛋白和Neopterin等。CD4计数常用，CD4/CD8小于1提示感染。 3、核酸定性：DNAPCR或 RT-PCR，阳性不能单独用于感染的诊断，阴性不排除感染。 4、P24抗原检测：阳性结果需经中和实验确认，才提示HIV感染。阴性不排除感染，因敏感性低：3080。 5、病毒分离：特异性好，但敏感性不高，潜伏期难分离 6、流行病学调查和临床症状：近期是否有HIV高危行为，是否有急性期的相关症状。,四、HIV感染的早期（窗口期）诊断,1、 早期诊断的意义 通常窗口期急性感染时出现病毒血症，此期间病毒载量，P24抗原均很高，是HIV快速复制阶段，具有高感染力；以下情况下，非常有必要尽快开展HIV感染早期诊断： （1）安全用血-窗口期血液筛查； （2）个体需求-暴露后诊断，包括通过输血、静脉吸毒、针刺等的血液暴露，以及同性恋、异性恋等性途径暴露； （3）各种职业暴露后的风险评估，医生警察。,2、早期感染的诊断方法,抗原检测 P24抗原EIA试剂试剂盒在血清抗体阳转