7.植物细胞代谢产物制备i

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1、第9章 植物细胞代谢产物制备I,第四篇 生物制品生产,第9章内容安排： I：植物细胞培养,II：植物细胞培生产次级代谢产物的应用举例分 析与讨论,III：植物组织培养及应用举例分析,本节主要内容：,1.植物细胞培养技术,本节关键问题：,1.植物细胞的特点,2.植物细胞培养方式：悬浮培养、固定化培养 3.植物细胞培养的生物反应器,一 植物细胞培养的定义,植物细胞培养（Plant cell culture）是在离体条件下，将分离的植物细胞通过继代培养增殖，获得大量细胞群体的一种技术。,获得的细胞群体可以作为制备有价值代谢产物的原料，也可以作为基础研究的材料。,同时植物细胞培养技术也是人工种子、原生

2、质体培养、花药培养等的支撑技术。,二 植物细胞特点 问题1：与微生物 相比，植物细胞有 什么特点？,细菌，真菌、植物细 胞都有细胞壁。,细菌无成形的细胞,核，真菌、植物细胞 有成形的细胞核。,细菌只有核糖体一种 细胞器。,植物细胞比微生物细 胞大。,植物细胞直径一般约为10-200m，平均直径比微生物细胞大30-100倍。,植物细胞很少以单一细胞形式悬浮生长，通常以一定细胞数的非均相细胞团方式存在。,植物细胞具有纤维素细胞壁和大的液泡，很容易被剪切力损伤。,与微生物细胞相比，植物细胞生长速度慢，操作周期长，分批培养一般需要2-3周，半连续或连续培养时间一般长达2-3个月。,植物细胞培养基成分丰

3、富而复杂，适合微生物生长，因此防止污染更困难。,植物细胞培养一般需要光照，通过光合作用合成有机物，因此氧气和CO2的含量与传递对细胞培养影响较大。,三 植物细胞培养历史,20世纪50年代，泰尔克（Talecke）和尼克尔,（Nickell）证实植物细胞可生长在悬浮培养液中。 随后，人们发现离体培养的植物细胞具有合成代 谢产物的能力。1956年，尼克尔（Nickell）和卢 荻（Routin）申请了第一个用植物细胞培养生产 化学物质的专利。,20世纪80年代后期，紫草宁等细胞培养生产次获得了产业化（紫草宁可以用作创伤、烧伤以及痔疮的治疗药）。,四 植物细胞培养技术,（一）培养基,植物细胞培养的培

4、养基主要由碳源、氮源、无机盐、维生素、植物生长激素、有机酸和一些复合物质组成。目前应用广泛的基础培养基有MS、B5、N6等，具体内容参见5.2.2一节。,问题2：植物组织培养的培养基组成有哪些？,无机盐：大量元素NSPKCaMg等、微量元素 有机物：糖类、氨基酸、维生素等 调节物质：激素,与微生物培养基相比：需要大量无机盐；多种维生素和激素；一般采用无机氮源；一般以蔗糖为碳源。,（二）植物单细胞分离与初步培养 植物细胞培养首先需要从植物样品制备单细胞。 问题3：植物组织培养、细胞融合时单个植 物细胞是如何获得的？ 1.酶解法 选择专一性水解酶在温和的条件下将 植物细胞壁物质（纤维素、果胶、多糖

5、）降解， 从而使细胞彼此分开，这种方法称为酶解法。 经常采用的生物酶包括：纤维素酶、果胶酶、琼 脂酶等。,2.愈伤组织法,通过培养植物外植体诱导产生愈,伤组织，并使其大量增殖，再通过机械震荡或者 酶解的方法使细胞分离从而获得游离的细胞。,看护培养（nursing,culture）,用一块活跃生,长的愈伤组织来看护单个 细胞，使其持续分裂和增 殖。这块愈伤组织被称为 看护组织。由缪尔（Muir） 于1953年创立。 具体方法：将单个细胞接 种于滤纸上，再置于愈伤 组织之上培养。优点是： 简便、成功率高。缺点是 不能在显微镜下直接观察。,饲养层培养（Feeder layer culture）,把处

6、理,过的（如X射线处理）无分裂能力或分裂很慢的细 胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长。,（三）继代培养,1.固体培养,平板培养法是经常采用的一,种固体培养方式，将一定量细胞接种到或 混合到装有一薄层固体培养基（含琼脂 Agar）的培养皿内进行培养。类似于微生 物细胞的平板培养，具体步骤包括：单细 胞悬浮液的制备、计数、调节细胞密度、 培养基选择、浇平板、接种培养。,2.液体培养 采用液体培养基进行细胞培养。,（四）植物细胞悬浮培养,细胞悬浮培养（Cell suspension culture） 是将细胞接种于液体培养基中并保持良好的 分散状态的培养方式。,植物细胞悬浮培养主要在摇床和生物反

7、应器中进行，培养方法与微生物类似。,优点：,1.可以增加细胞与培养液的接触，促进营养 的吸收。,2.保证良好的混合状态，从而获得良好的气 体传递效果。,3.可以达到较高的细胞浓度，容易放大培养。,悬浮培养的生物反应器,一般所说的生物反应器是指细胞培养生物反 应器，是为细胞生长提供合适的化学与物理 环境并能检测控制细胞生长的装置。,一般都有三部分组成：反应罐、控制系统、 检测分析系统。,问题4.与传统微生物发酵罐相比，植物细胞培养的生物反应器有什么特点？,植物细胞培养的特殊要求,植物细胞培养反应器最初大多采用微生物反应器。由于植物细胞与微生物细胞形态结构不同，植物细胞较微生物细胞大，对剪切力耐受

8、性差，而且对氧的要求相对微生物要低得多，因此微生物反应器并不完全适合于植物细胞生长与生产。,植物细胞培养具有周期长、细胞抗剪切能力弱、易团聚等特点。同时，植物细胞规模培养的目的是生产天然产物，而这些天然产物均为细胞次生代谢物。所以，植物细胞培养反应器的设计，不仅要考虑有利于细胞生长，同时还要考虑有利于产物的积累和分离。总体上讲，适合植物细胞的反应器应该具有适宜的氧传递、良好的流动性和较低的剪切力。,光照的提供：外光源、内光源，透明材料。 结构尽量简单。,植物细胞培养的特殊要求,机械搅拌式生物反应器（Stirred tank rioreactor）,一般由罐体、搅拌桨、控温系统、气路、 传感器等

9、组成。依靠搅拌器使液体产生轴向流动和径向流动。该生物反应器的优点是搅拌充分，供氧能力和混合效果较好。 搅拌罐中产生的剪切力大，容易损伤细 胞，直接影响细胞的生长和代谢，特别对于次级产物生成影响极大。需要对搅拌罐进行改进，包括改变搅拌形式、叶轮结构与类型、空气分布器等，力求减少产生的剪切力，同时满足供氧与混合的要求。,不同叶轮产生剪切力大小顺序为：,涡轮状叶轮平叶轮折叶浆螺旋状叶轮,Kaman等采用带有1个双螺旋带状 叶轮(helicalribbonimpeller)和3个 表面挡板的搅拌罐，证明适于剪 切力敏感的高密度细胞培养。 离心桨生物反应器采用三叶螺旋 桨，同时采用微孔金属丝网作为 空气

10、分布器，能提供良好的混合 状态，具有比机械搅拌桨底的剪 切力。,气升式生物反应器(Air-lift,bioreactor),由气升室、气降室、除气室和 底部四部分组成。,培养液循环的动力来自于气升 室、气降室中因含气量不同而 在底部产生的压力差，因而比 鼓泡型有更均一的流动形式。 根据反应器内部结构与气体分 布器的位置不同可分为内环流 和外环流两种。,鼓泡式生物反应器(Bubble column bioreactor) 又称为鼓泡塔式反应器，是最简单的气动式生物反应器。气体分布器一般位于底部中央，气体从底部通过喷嘴或孔盘进入反应器。它不含转动部分，整个系统密闭，易于无菌操作。不同于气升式生物反

11、应器，液体在反应器内部呈无规律的湍流状态。培养过程中没有机械能消耗，适合于培 养对剪切力敏感的细胞。然而对高密度及粘度较大的培养物，反应器的混合效率会降低。,其它类型生物反应器,转鼓式生物反应器 (Rotating drum bioreactor),因为转子的转动带动培养 罐转动，促进了气体交换 与营养物质的吸收，具有 悬浮系统均一、低剪切力 、防止细胞粘附在壁上的 优点，适合于高密度植物 悬浮细胞的培养，已用于 长春花、紫草的细胞悬浮 培养。,（五）植物细胞固定化培养,问题5：植物细胞固定化培养有什么优点？,细胞固定化培养（Cell immobilization,culture）是指将游离的

12、细胞包埋在支持物内部 或表面进行培养的一门技术。,是在20世纪70年代的酶固定化催化技术基础上发 展起来的。,1979年，布洛德利斯（Brodelius）首次成功利 用固定化的毛地黄、长春花细胞制备次级代谢产 物。,1.细胞经包埋后使所受的剪切力损伤减小，维持了细胞 的稳定性，适合脆弱的植物细胞的培养，同时也利于采 用传统生物反应器大规模培养。,2.悬浮细胞培养体系中细胞密度比较高时会因粘度增加 引起传质困难。固定化细胞培养系统中细胞密度远高于 悬浮培养，但并不会改变培养液流体性质，利于传质。,3.大多数植物次级代谢产物合成在生长停止后才大量合 成。采用固定化培养可以将细胞生长与产物合成分成两

13、 个阶段。,与细胞悬浮培养相比，植物细胞固定化培养具有以下优点：,4.细胞生长较为缓慢，利于次级代谢产物的积累。,5.固定化增加了细胞与细胞间的接触，促进了细胞 间信息传递，利于代谢产物的合成。,6.固定化细胞可以反复使用，可以方便地进行产物 的连续性收获，降低了成本。,1.固定化方法,吸附、交联、共价结合、包埋等。,（1）吸附固定法 通过物理吸附、离子吸附（ 依靠静电引力固着在带有异电荷的载体上）等方 法使细胞固定在载体上。,（2）共价结合法 细胞表面的基团（如氨基、 巯基、咪唑基、酚羟基等）和固相支持物表面的 基团之间形成化学共价键连接，从而成为固定化 细胞。,（3）包埋法,凝胶包埋 ht

14、tp:/ 的哪个内容相似？,无菌空气入口 装有细胞和褐藻酸钠溶液的玻璃瓶 细胞和褐藻酸钠混合液,空气出口,形成胶体颗粒的喷射口 隔滤板 装有氯化钙溶液的烧瓶,微囊化（Microencapsulation）是利用天然的或 者合成的高分子材料作为囊壁材料将细胞包裹成 微米级的微小球囊，形成的微囊膜是亲水半透膜 ，培养基的营养成分以及代谢产物可以通过微囊 膜进行交换。,在Ca2+离子等多价阳离子的存在下，海藻酸盐的羧基 和阳离子之间形成离子键。因海藻酸钙不溶于水，从 而在细胞表面形成凝胶。,如果采用磷酸、柠檬酸、EDTA等螯合剂处理将Ca2+离 子除去，又能使胶体溶解释放出细胞。,当海藻酸钙微囊用多

15、聚赖氨酸处理后，使凝胶微球表 面成膜，不会再被螯合剂溶解。再用柠檬酸去除钙离 子，球内海藻酸钠成液态，细胞悬浮在微囊内。,海藻酸盐(Alginate) 多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine)微囊化,琼脂糖(Agarose)凝胶包埋 将细胞悬浮于经过灭 菌处理的琼脂糖中，不断搅拌，待混合物凝结后 ，将包埋有细胞的琼脂糖凝块挤进无菌的金属网 中，使其分散成小颗粒。清洗颗粒后转入适当的 培养基中进行培养。,这种方法虽然简单，但因制得的颗粒较大、形状 不规则。,2.固定化细胞的活力测定,染色法 例如：荧光素二乙酸酯（Fluorescein diacetate,FDA）染料能被活细胞吸收，酶解脱去 乙

16、酰基而使这种染料产生荧光。死亡的细胞没有 这种现象，因此可以判定固定化后的细胞是否具 有活性。,呼吸强度测定 采用氧电极法测定细胞的呼吸作 用来表示细胞的存活率。,细胞生长和分解速率的测定 细胞数量或重量的 增加可以作为细胞活性的指标。由于植物细胞的 聚集性特点，采用湿重或干重法比较方便实用。,3.固定化细胞培养的生物反应器,对于固定化的植物细胞可以：,（1）采用合适的机械搅拌式生物反应器、气升 式生物反应器、鼓泡式生物反应器等进行培养。 （2）也可将细胞直接吸附或包埋在特殊设计的 生物反应器内的介质表面或内部进行培养。,流化床生物反应器(Fluid-bed bioreactor)通过 通入液体或气体使固定化细胞悬浮于反应器中。 传质效率高，但是碰撞会破坏固定化细胞。,填充床生物反应器(Pipe-cone bio-filter reactor) 细胞固定在支持物的内部或表面 ，细胞固定不动，流体按照一定 方向从反应器中流过实现混合和 传质。 可以是垂直的，也可以是