7.8生物技术制药-酶工程.ppt

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1、第四章 酶工程制药,第一节 概述 第二节 酶的来源与生产 第三节 酶和细胞的固定化 第四节 固定化酶和固定化细胞的反应器 第五节 酶工程在医药工业的应用 第六节 酶工程研究的进展,新兴、前沿学科往往在学科交叉中产生,第一节 概述,生物技术,医药生物技术 农业生物技术 工业生物技术 环境生物技术 材料生物技术 . . .,用生物或生物分子机器生产产品和解决问题,生物技术的具体应用,生物技术产业化的三个浪潮,医药生物技术: 1982年重组人胰岛素上市 农业生物技术: 1996年转基因大豆、玉米、油菜相继上市 工业生物技术: 世纪之交聚交酯、生物钢、聚乳酸相继上市,工业生物技术-迈向发达国家之战略,

2、工业生物技术,含意：在工业规模的生产过程中使用或部分使用生物技术来实现产品的制造，这种技术是应用微生物和生物催化剂来提供产品和服务 核心目标：大规模利用生物体系（如细胞或酶）作为催化剂实现物质转化,工业生物技术是生物技术的重要组成部分,工业生物技术发展空间,提升传统产业 生物能源 环境生物技术 生物材料,底物,生物反应器,检测控 制仪表,培养基,（灭菌）,经加工 原料,酶,细胞,生物催化剂 （游离或固定化）,机械能,除 菌,空气,产品提取纯化,副产品 产品 废物,热能,原材料,营养物,典型工业生物技术过程,核心技术？,生物催化（Biocatalysis),利用酶或有机体（细胞或细胞器等）作为催

3、化剂实现化学转化的过程。,生物转化（Biotransformation),生物催化,化学工业,发酵工业,轻工业,采矿,医药,食品,能源,材料,生物安全,环境,生物催化是工业生物技术的核心技术,以生物催化法合成的主要产品,趋势判断和需求分析,生物催化剂在精细化学品市场中呈现强劲的增长势头。 到2020年，通过生物催化技术，将实现化学工业的原料消耗、水资源消耗、能量消耗降低30%，污染物的排放和污染扩散减少30%。,趋势判断和需求分析,目前生物催化技术已成为各公司争夺的目标并且已成为一些公司谋求发展和提升地位的工具 。 Degussa、DSM、Roche、BASF、Dow、Lonza等许多跨国公司

4、都在积极采取措施，扩大他们在生物催化领域里的生产能力。,生物催化发展的主要推动力,新产品需求 (社会压力) -健康：医药、检测 -日用品：洗涤用品、乳品、生物可降解塑料 环境 (法律法规压力) 绿色化学、能源、温室效应 新发现或基础研究 (技术压力） 基因工程 /定点突变/定向进化、代谢工程、组合化学 得益/成本降低 (商业压力) -生物分离,The Biocatalysis Cycle,生物催化剂工程的目标,开发生物催化剂：催化性能更好、更快，成本更低 开发生物催化剂工具合：催化反应更广泛，功能更多样 改善性能: 稳定性, 活性，溶剂兼容性 开发分子模型: 新酶的快速重新设计 创造新技术:

5、用于新生物催化剂的开发,生物催化剂发展的工业展望,生物催化剂工程技术瓶颈,对生物催化剂作用机理缺乏深入的认识 对次级代谢产物代谢途径（包括途径间相互关系）缺乏理解 细胞工程化的方法十分有限（即代谢工程） 生产酶和辅因子的成本过高,当前生物催化的研究热点,新酶或已有酶的新功能的开发 根据已有底物开发新的酶反应 利用突变或定向进化技术改善生物催化剂性能 利用重组DNA技术大规模生产生物催化剂 利用有机溶剂或共溶剂开发新的反应体系 体内或体外合成的多酶体系 克服底物和产物抑制 精细化工品或医药合成技术的放大 辅因子再生 生物催化剂的修饰 生物催化剂的固定化,生物催化剂高效生产与催化功能研究,强化微生

6、物细胞培养与发酵的调控措施，研究酶的诱导策略 实现生物催化剂的自主和规模生产 分析生物催化剂所催化的特定基团开辟全新的生物催化反应,什么是酶？,酶是蛋白质 酶是催化剂 酶是具有催化作用的蛋白质,什么是酶促反应？,由酶催化的生物化学反应,酶学研究简史,1878 德国的Kuhne 定义Enzyme 原意为在酵母中 1926 美国的Sumner从刀豆中得到脲酶结晶（1947年诺贝尔奖） 1970 美国的Smith 发现限制性内切酶（1979年诺贝尔奖） 1969 日本固定化氨基酰化酶，第一次将固定化酶成功地应用于工业生产。酶工程诞生 1986 美国 核酶发现获得诺贝尔奖,国际市场酶制剂销售额比例 2

7、001年工业酶制剂的世界市场约为15亿美元 用于制药工业与精细化学工业约1.2亿1.5亿美元,一酶的分类：,1氧化还原酶 2转移酶 3水解酶 4裂合酶 5异构酶 6连接酶（合成酶） 7核酸酶（催化核酸）,1氧化还原酶 (Oxidoreductase),包括脱氢酶(Dehydrogenase) 、氧化酶(Oxidase) 、过氧化物酶、氧合酶、细胞色素氧化酶等,2转移酶(Transferase),包括酮醛基转移酶、酰基转移酶、糖苷基转移酶、含氮基转移酶等,3水解酶(Hydrolase),脂肪酶、糖苷酶、肽酶等，水解酶一般不需辅酶,4裂合酶(Lyase),这类酶可脱去底物上某一基团留下双键，或可相

8、反地在双键处加入某一基团。,5异构酶(Isomerase),此类酶为生物代谢需要对某些物质进行分子异构化，分别进行外消旋、差向异构、顺反异构等,6连接酶（合成酶）(Ligase or Synthetase),这类酶关系很多生命物质的合成，其特点是需要三磷酸腺苷等高能磷酸酯作为结合能源，有的还需金属离子辅助因子。分别形成C-O键（与蛋白质合成有关）、C-S键（与脂肪酸合成有关）、C-C键和磷酸酯键。,7.核酸酶（催化核酸） Ribozyme,核酸酶是唯一的非蛋白酶。它是一类特殊的RNA，能够催化RNA分子中的磷酸酯键的水解及其逆反应。,酶用于生物催化的概况,酶与酶促反应的特点,易变性 蛋白质结构

9、易受环境变化而改变 催化效率高 专一性强 特定的酶催化特定的反应,酶的特点,反应条件温和 生物化学反应在常温常压下进行 酶的催化活性受到调节与控制,酶促反应的特点,酶的聚集方式,酶1,1.松散排列 酶在细胞中各自以可溶的单体形式存在，彼此没有结构上的联系。 反应时酶是随机扩散，催化效率不高。（如糖酵解历程）,酶2,酶3,酶4,酶5,酶的聚集方式,2.簇式排列 几种酶有机地聚集在一起，精巧的镶嵌成一定的结构，定向转移，形成多酶复合体。催化效率高。 （如丙酮酸脱氢酶复合体、 脂肪酸合成酶复合体）,酶2,酶3,酶1,酶4,酶6,酶5,酶的聚集方式,3.与生物膜结合 一种结构更高的多酶复合体，酶整齐的

10、排列在生物膜上。催化效率最高。（如呼吸链）,酶1,酶2,酶4,酶5,酶3,酶的组成,酶的化学组成 1.单成分酶（单纯蛋白质/简单蛋白质） 2.双成分酶（结合蛋白质） (1)蛋白质部分（酶蛋白） 稳定辅因子 (2)非蛋白质部分（辅因子） 起催化作用 小分子有机化合物 金属离子 全酶=酶蛋白+辅因子,酶的结构,结合部位,酶,活性中心以外的必需基团,其它部分,必需基团,活性中心,催化部位,酶活性中心示意图,酶的催化作用机理,中间产物学说 酶作用专一性机理 1.锁钥学说 2.诱导契合学说酶受底物诱导而变形 3.张力学说（应变效应）底物变形以适应酶 酶作用高效性机理 -影响酶高效性的因素 1.邻近定向效

11、应 2.应变效应 3.亲核催化/亲电催化（共价催化） 4.酸碱催化 5.微环境的影响,酶催化作用的中间产物学说,E + S ES P + E （酶 ） 底物） （中间物 ） （产物 ） （酶） 中间产物存在的证明： H2O2 + 过氧化物酶 （H2O2 过氧化物酶） （ 褐色） （ 红色） 645587548498nm 561550nm （H2O2 过氧化物酶）+ AH2 过氧化物酶 + A + 2H2O （ 红色） （ 褐色）,锁 钥 学 说,诱导契合学说,邻 近 定 向 效 应,综上所述： 酶与底物结合时，由于酶的变形（诱导契 合）或底物变形（张力学说）使二者相互适合， 并依靠离子键、氢键

12、、范德华力的作用和水的 影响，结合成中间产物，在酶分子的非极性区 域内，由于酶与底物的邻近、定向，使二者可 以通过亲核亲电催化、一般酸碱催化或金属离 子催化方式进行多元催化，从而大大降低反应 所需的活化能，使酶促反应迅速迅速进行。,酶催化作用机理,影响酶促反应的因素,一.底物浓度S,四.pH,二.酶浓度 E,三.温度pH,五.激活剂 （1）激活剂(activator) 凡能使酶由无活性变为有活性或使酶活性提高的物质，通称为激活剂。 （2）激活剂(activator)种类 大部分是无机离子或简单的有机小分子。 如Mg2+是多种激酶和合成酶的激活剂； Cl-是唾液淀粉酶最强的激活剂。 一些小分子有

13、机物，如抗坏血酸、半胱氨酸、还原型谷胱甘肽等，对某些巯基酶具有激活作用。 这是由于这些酶需要其分子中的巯基处于还原状态才具有催化作用。还有些酶的催化作用易受某些抑制剂的影响，能除去抑制剂的物质也可称为激活剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)。它是金属螯合剂，能除去重金属离子，从而解除重金属对酶的抑制作用。,六.抑制剂 .抑制剂(inhibitor) 凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂。 竞争性抑制 可逆抑制 非竞争性抑制 反竞争性抑制 不可逆抑制, 竞争性抑制作用：此类抑制剂一般与酶的天然底物结构相似，可与底物竞争酶的活性中心，从而降低酶与底物的结合效率，抑制酶的活性。这种抑制

14、作用称竞争性抑制作用(competitive inhibition)。 特征：a.由于抑制剂与酶的结合是可逆的，抑制强度的大小取决于抑制剂与酶的相对亲和力以及抑制剂与底物浓度的相对比例。 b.通过增加底物浓度可降低或消除抑制剂对酶的抑制作用。,竞争性可逆抑制图示, 非竞争性抑制作用 有些抑制剂可与酶活性中心以外的必需基团结合，但不影响酶与底物的结合, 酶与底物的结合也不影响酶与抑制剂的结合，但形成的酶-底物-抑制剂复合物(ESI)不能进一步释放出产物，致使酶活性丧失。这种抑制作用称为非竞争性抑制作用(non-competitive inhibition)。,非竞争性可逆抑制图示,不可逆抑制作用

15、 不可逆抑制作用(irreversible inhibition)的抑制剂，通常以共价键方式与酶的必需基团进行结合，一经结合就很难自发解离，不能用透析或超滤等物理方法解除抑制。其实际效应是降低反应体系中有效酶浓度。抑制强度取决于抑制剂浓度及酶与抑制剂之间的接触时间。 按其作用特点，不可逆抑制有专一性及非专一性之分。,专一性不可逆抑制剂 此类抑制剂专一地与酶的活性中心或其必需基团共价结合，从而抑制酶的活性。 例如：有机磷杀虫剂能专一地作用于胆碱酯酶活性中心的丝氨酸残基，使其磷酰化而破坏酶的活性中心, 导致酶的活性丧失。 有机磷杀虫剂的杀虫机理：当胆碱酯酶被有机磷杀虫剂抑制后，胆碱能神经末稍分泌的乙酰胆碱不能及时分解，过多的乙酰胆碱会导致胆碱能神经过度兴奋，使昆虫失去知觉，人和家畜产生多种严重中毒症状，甚至死亡。 非专一性不可逆抑制剂 此类抑制剂可与酶分子结构中一类或几类基团共价结合而导致酶失活。它们主要是一些修饰氨基酸残基的化学试剂,可与氨基、羟基、胍基、巯基等反应。 例如：烷化巯基的碘代乙酸、某些重金属(Pb2+、Cu2+、Hg2+)及对氯汞苯甲酸等，能与酶分子的巯基进行不可逆结合。,什么是酶工程,是酶学与工程学相互渗透结合的产物 工程学 设计