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1、第十二章 核酸的生物合成 Chapter 12 Biosynthesis of DNA and RNA,第一节 DNA的生物合成,一、生物遗传信息和基因 （一）概念 1、生物遗传信息：以DNA的碱基顺序形式储存于细胞之中。 2、基因：遗传信息的最小单位是基因，一个DNA分子中包含许多基因。 DNA是遗传信息的储存者（载体），RNA是遗传信息的传递者，蛋白质是遗传信息的体现者。,（二）遗传信息的流向（中心法则）,Watson Crick于1953年提出了DNA双螺旋结构模型 不久Crick提出了中心法则： DNA RNA Protein,1961年Temin等人发现了反转录酶（1970年才得到承
2、认），以及随后发现的RNA复制酶和朊病毒（Prion）是对Crick提出的中心法则的挑战 。 朊病毒（Prion）：是一种引起人类Kuru病、CJD病、GSS病；动物的疯牛病（mad cow disease)、羊瘙痒病等疾病的蛋白质因子。,二、DNA复制的半保留方式 （一）半保留复制的概念 1953年由Watson Crick提出了DNA半保留复制假设。 1958年Meselson和Stahl首次用实验直接证明了DNA的半保留复制。,（二）DNA复制的起始点和方向,起始点的特点：DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段，即复制起始点（复制子）。 在原核生物中，复
3、制起始点通常为一个，而在真核生物中则为多个。 复制的方向：DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行复制。但在低等生物中，也可进行单向复制（如滚环复制）。,式：大肠杆菌等细菌的核基因组主要以这一方式复制，原核生物的DNA是环状双链DNA分子。其复制起始点（ori）附着于质膜上，复制时，由ori位点先复制，同时伴随着质膜的增生，随着DNA复制和膜增生的延续，最终形成两个DNA分子,（三）原核生物DNA的复制,1、半不连续复制 由于DNA聚合酶只能以53方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的方向必须为35。因此，分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时的方式是不同的。,以35方向的亲
4、代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为53，这一条链被称为领头链、先导链(leading strand)。而以53方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是53，这条链被称为随从链、后续链(lagging strand)。,SSB,2、与DNA合成有关的酶（蛋白质）,DNA复制的酶类和蛋白质,DNA合成的前体是4种脱氧核苷三磷酸：dATP、dGTP、dCTP、dTTP。 1、DNA聚合酶： 催化DNA链从53端延长。 2、DNA连接酶 将冈崎片段连接成DNA链，催化一个DNA片段的5-磷酸根与另一个DNA片段的3-OH形成磷酸二酯
5、键。,3、引发酶 即引物合成酶，催化RNA引物合成。 4、DNA旋转酶 松弛或形成超螺旋 ATP ADP+Pi DNA松弛态 超螺旋态DNA 5、DNA解链酶和单链结合蛋白（SSB） 解链酶使双螺旋DNA解链；SSB稳定单链区。,3、半不连续复制的相关概念,冈崎片段：1968年冈崎等用3H脱氧胸苷掺入噬菌体感染的大肠杆菌，然后分离标记的DNA产物，发现短时间内首先合成的是较短的DNA片段，接着出现较大的分子。这些DNA片段称为冈崎片段。,半不连续复制的特点：新DNA的一条链是按53方向（与复制叉移动的方向一致）连续合成的，称为“前导链”；另一条链的合成是不连续的，先按53方向合成若干短片段（冈
6、崎片段），再通过酶的作用将这些短片段连在一起构成第二条子链，称为“后随链”。,4、DNA复制的分子机制（基本过程）,起始阶段：形成DNA模板RNA引物DNA聚合酶三元复合物。 除连接酶外其他各类酶都起作用。 延长阶段：一个复制叉，可以合成一个“前导链” （连续合成的）和一个“后随链”（是不连续合成的，经连接酶的作用形成。）。 终止阶段：是DNA合成的终止和两个子代DNA分开的过程。,(四)真核生物DNA的复制,1、真核生物的DNA聚合酶：目前发现有五种，分别命名为DNA聚合酶（pol ），DNA聚合酶（pol ），DNA聚合酶（pol ），DNA聚合酶（pol ），DNA聚合酶（pol ）。,
7、2、真核生物端粒的形成： 端粒（telomere）是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。其共同的结构特征是由一些富含G、C的短重复序列构成，可重复数十次至数百次。,线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。 端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它可以其RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。,三、基因工程,内切酶DNA分子的“手术刀” 连接酶DNA片段的“缝衣针” 载 体DNA转移的“交通工具” 核心技术：DNA重组技术,基因重组技术,四、多聚酶链式反应（PCR）技术,五、
8、cDNA文库的构建,（一）cDNA文库（library） cDNA文库是指得到足够多的分别克隆的cDNA片段，汇集这些克隆应包含某种细胞中各种mRNA的相应顺序，每种顺序至少有一份拷贝，这种克隆片段的汇集体称为某种细胞的cDNA文库。,为了得到特定基因的cDNA片段，就需要先分离出有功能的特定mRNA。所以首先必须考虑从什么细胞，用什么方法将提取出来。这是由于不同细胞可限定合成不同的蛋白质，这样在一些组织细胞中除了含有普通蛋白质的mRNA外，还会有数量较多的特定mRNA。,（二）mRNA的分离,mRNA的分离有许多种方法，例如化学的方法，物理的方法（如差速梯度离心法）等。有的还可以利用真核生物
9、的mRNA具有的poly A尾巴进行亲和层析法分离mRNA。有的则采用几种方法联合使用，其总的目标就是获得纯度高、得率高的有活性的mRNA。 ,（三）构建cDNA文库,在取得专性的mRNA后，接下来就是将mRNA通过反转录酶合成杂种DNA链（DNA-RNA分子），在碱（KOH）作用下水解RNA链，然后经DNA聚合酶作用再合成第二条DNA链，即形成双链cDNA分子，将双链cDNA插入载体后形成重组体，并导入细菌中，随细菌的繁殖而扩增和克隆，形成cDNA文库。,第二节 RNA的生物合成,一、不对称转录 基因（有义链） 3 mRNA 5 5 3 3 5 反义链,在RNA聚合酶的催化下，以一段DNA链
10、为模板合成RNA，从而将DNA所携带的遗传信息传递给RNA的过程称为转录。 经转录生成的RNA有多种，主要的是rRNA，tRNA，mRNA，snRNA和HnRNA。,二、RNA聚合酶： 这是一种不同于引物酶的依赖DNA的RNA聚合酶。该酶在单链DNA模板以及四种核糖核苷酸存在的条件下，不需要引物，即可从53聚合RNA。 大肠杆菌RNA聚合酶全酶形式：2/ 2/称核心酶，有活力。 因子：辨认模板DNA链上的起始位点。,真核生物中的RNA聚合酶可按其对-鹅膏蕈碱敏感性而分为三种，它们均由1012个大小不同的亚基所组成，结构非常复杂，其功能也不同。,三、转录过程（原核生物）,1、形成“全酶DNA”复
11、合物 RNA聚合酶 2/中的因子专门辨认模板DNA链上的起始位点，使全酶结合在起始位点上，形成“全酶DNA”复合物。 2、转录的起始 加入4种NTP，在全酶的作用下，开始起始反应，产生第一个核苷酸间磷酸二酯键。,3、RNA链的延伸 因子从全酶DNA复合物中脱落下来，由“核心酶”催化RNA的合成。当酶沿模板链移动时，DNA解旋也随着一起进行，而原来分开的部位则重新形成完整的双螺旋。 4、转录的终止 当转录到一定长度时，和RNA聚合酶结合的转录终止辅助因子NusA蛋白帮助酶识别DNA模板上的终止信号（终止子），并在因子帮助下终止转录，释放转录产物RNA（包括mRNA，tRNA，rRNA）。,四、与
12、转录有关的概念,1、启动子（promoter) 2、Pribnow盒（原核生物） 3、Hogness盒或TATA盒（真核生物） 4、真核基因的转录产物为单顺反子,5、锌指结构：是许多转录因子所共有的DNA结合结构域。由一段富含Cys的多肽链构成。每4个Cys残基或His残基螯合1分子Zn2+，其余约12-13个残基则呈指样突出，刚好能嵌入DNA双螺旋的大沟中而与之相结合。,见王镜岩下册P. 467,6、亮氨酸拉链结构： 是真核生物转录调控蛋白与DNA结合的模体之一。由两段-螺旋平行排列构成，其-螺旋中存在每隔7个残基规律性排列的Leu残基，Leu侧链交替排列而呈拉链状。两条肽链呈钳状与DNA结
13、合。 见王镜岩下册P.468,四、转录后加工过程,1、mRNA前体的加工（真核生物） 内含子转录顺序的切除 5一端帽子的形成(如： m7G 5ppp 5Np，即O型) 3一端尾巴的形成 甲基化修饰,端的帽结构,即在mRNA的5-端加上m7GTP的结构。此过程发生在细胞核内，即HnRNA即可进行加帽。 加工过程首先是在磷酸酶的作用下，将5-端的磷酸基水解，然后再加上鸟苷三磷酸，形成GpppN的结构，再对G进行甲基化。 （m7GpppNm）。,过程： pppGpNp- ppGpNp- ppGpNp-+GTP GpppGpNp- GpppGpNp-+SAM m7GpppGpNp-,核苷酸磷酸水解酶,
14、mRNA鸟苷酸转移酶,mRNA嘌呤7-甲基转移酶,加尾(adding tail)： 这一过程也是细胞核内完成，首先由核酸外切酶切去3-端一些过剩的核苷酸，然后再加入polyA。polyA结构与mRNA的半寿期有关。,剪接（splicing)： 真核生物中的结构基因基本上都是断裂基因。结构基因中能够指导多肽链合成的编码顺序被称为外显子，而不能指导多肽链合成的非编码顺序就被称为内含子。 真核生物HnRNA的剪接一般需snRNA参与构成的核蛋白体参加，通过形成套索状结构而将内含子切除掉。,内部甲基化： 由甲基化酶催化，对某些碱基进行甲基化处理。,RNA加工包括三个步骤,2、tRNA的转录后加工,切断。 剪接。 化学修饰。 添加3端的-CCAOH,3、rRNA的转录后加工,第三节 RNA的复制,在RNA病毒中，其遗传信息贮存在RNA分子中。因此，在这些生物体中，遗传信息的流向是RNA通过复制，将遗传信息由亲代传递给子代。 RNA复制酶：依赖RNA的RNA聚合酶,
