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1、,第四章 基因工程的主要技术及原理,核酸的提取与纯化,核酸电泳,分子杂交,PCR技术,DNA序列分析,大分子相互作用,分子杂交 (molecular hybridization)：利用带有标记（放射性同位素(32P或125I)、生物素或荧光酶等）探针（DNA、RNA或蛋白质）进行相同或不同种类分子间相互特异识别而发生结合的过程。,第三节 核酸和蛋白质的分子杂交,支持物不同,分子杂交分类,分子杂交流程图,样 品 制 备,电 泳,杂 交,转 膜,结 果 显 示,探针/抗体制备,按片断长短进行分离,凝胶中的片段转移到固相支持物,DNA/DNA DNA/RNA 抗原/抗体,提取DNA/RNA/蛋白,放
2、射自显影 荧光检测 显色技术,一小段用放射性同位素、生物素或荧光染料进行标记的已知序列的核酸片段，即为探针（probe） 探针可用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来。,根据标记物不同可分为放射性探针和非放射性探针两大类； 放射性标记物（ -*N-dNTP ） 32p(14d)、35S(87d)、3H(12y)和125I(60d) 非放射性标记物,一、核酸探针,非放射性标记物的种类,半抗原：地高辛，利用半抗原的抗体进行免疫学检测。 配体：生物素，是一种抗生物素蛋白avidin和链亲和素streptavidin的配体。 荧光素：异硫氰酸荧光素和罗丹明，可被紫外
3、线激发出荧光而被检测到。 光密度或电子密度标记物： 金、银,根据探针的来源及核酸性质不同又可分为DNA探针，RNA探针，cDNA探针，及寡核苷酸探针等几类。,寡核苷酸探针（oligonucleotid probe）：是人工合成且被适当标记的由短链核苷酸组成的大分子（即一段比较短的DNA或RNA），能与被检测长链DNA或RNA进行分子杂交，且杂交后可由该分了上的标记显示目的长链DNA或RNA分子的存在。,常用寡核苷酸探针的标记物,放射性同位素标记： 32P、 33P、 35S,非放射性标记：生物素、地高辛,生物素dUTP、生物素dATP、地高辛dUTP等,（一）、探针的标记物,非放射性探针的标记
4、,生物素标记核酸 （光敏生物素、酶促生物素）,DNA半抗原标记 荧光素标记,以生物素化的脱氧核苷三磷酸（Bio-11-dUTP,Bio-7-dATP、Bio-11-dCTP）等代替相应脱氧核苷三磷酸，经DNA聚合酶作用掺入新合成的DNA。可以采用缺口平移法和随机引物延伸法进行。,生物素标记法,基本原理：,生物素-抗生物素蛋白-酶(Avidin-Biotin-Enzyme-Complex)ABC荧光标记,地高辛dUTP,杂交探针的标记：DNA半抗原标记-地高辛系统标记,地高辛（ Digoxigenin，DIG）是一种类固醇半抗原，来源于植物(Digitalis purouren 和Digital
5、is lanta)的花和叶中，其他生物体中不含有地高辛抗体 DIG 可以与dUTP反应形成DIG-dUTP，通过酶促法插入到合成的DNA探针中。通过酶标记的抗地高辛抗体来实施检测。,原理：,两种地高辛dUTP显色系统,非放射性核素探针的检测 偶联反应 半抗原:通过抗原-抗体反应与显色体系偶联。 配体:亲和法与显色体系偶联：生物素-抗生物素蛋白-酶（Avidin-Biotin-Enzyme-Complex ，ABC）,显色反应,通过连接在抗体或生物素蛋白的显色物质如酶、荧光素等进行杂交信号的检测。,（二）、核酸探针的常用标记方法,核酸探针的标记几乎总是先将脱氧单核苷酸底物标记相应的信号，然后利用
6、核酸合成的方法合成具有标记信号的核苷酸链,放射性探针的标记,缺口平移法（nick translation）,PCR法,DNA快速末端标记,T4多核苷酸激酶标记DNA 5末端,随机引物延伸,由DNase和大肠 杆菌DNA聚合酶 共同完成。,DNase：在双链 DNA上随机打开若 干个单链缺口，产 生3-OH端,大肠杆菌DNA聚合 酶：53DNA聚 合酶活性； 53 外切核酸酶活性,（1）缺口平移标记法（nicktranslation）,随机引物：含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物。46 = 4096,DNA聚合酶Klenow片段 53DNA聚合酶活性 弱35外切核酸酶活性 无53外切核酸
7、酶活性,（2）随机引物法（random priming）,产物平均长度为400-600个核苷酸。 Klenow片段没有5 3外切酶活性, 反应稳定, 可以获得大量的有效探针。 反应时对模板的要求不严格, 用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。,制备高比活性探针(1010 cpm/gDNA);,（3）末端标记法 T4 DNA聚合酶,53聚合酶活性，1500 nt/min, 为pol I的两倍 35外切酶活性，可作用于ssDNA和dsDNA, 其切除速度分别为40和 4000nt/min,适用于合成寡核苷酸探针的标记，用末端标记制备的探针一般携带的标记分子较少。,补平或标记DNA分子由核酸内切酶
8、产生的3凹端 对带有3黏性末端或平末端的DNA片段进行标记，制备探针,二、Southern 杂交 (Southern blotting ),基本原理 将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。,目标 DNA 经过限制性酶切并通过琼脂糖凝胶电泳,0.4N NaOH 变性 1.5M NaCl/1M Tris（pH7.4） 中和 使 DNA 仍保持单链状态,将凝胶上的 DNA 转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上 通过 80 处理或紫外线照
9、射将 DNA 固定在滤膜上,将结合了 DNA 分子的滤膜先与特定的预杂液进行预杂交， 将滤膜的空白处用鱼精 DNA 或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附,杂交：在一定的溶液条件和温度下，将标记的核酸探针与滤膜混合，如果滤膜上的 DNA 分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸附在滤膜上,洗膜：经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去,检测： 放射性标记、检测 非放射性标记、检测,分子杂交炉,紫外交联仪,三、Northern 杂交(Northern blotting ),基本原理,Northern blot是在变性条件下将待检RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳
10、，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。定性分析mRNA的常用方法,用于分析基因转录与否以及转录水平的变化，比较两个或以上不同组织或细胞某一已知基因转录水平的差异,三、Northern 杂交(Northern blotting ),1、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同 2、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳中不变性;不能用碱变性，防止水解。用甲基氢氧化银、乙二醇或甲醛变性。 3、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理，Southern印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理 4、靶核酸
11、为RNA 5、探针可用DNA或RNA片段,甲醛变性电泳： RNA变性，消除RNA中的二级结构，保证RNA完全按照分子的大小分离。 DEPC水处理电泳槽，去除RNA酶 在通风橱中加入甲醛，放置一段时间以减少甲醛蒸汽。,四、Western 杂交(Western blotting ),检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗体对蛋白质进行鉴定及定量的方法 免疫印迹（immunoblotting） Western blot是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。 可用于分析蛋白质水平的变化,四、Western 杂交(Western blotting ),经过P
12、AGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（如NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。,采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗,基本原理,主要步骤：,蛋白质样品的制备 SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳 蛋白质的电转移：NC膜 靶蛋白的免疫学检测 靶蛋白于第一抗体（一抗）反应 与标记的第二抗体（酶标，二抗）反应 显色反应：酶促反应,四、
13、Western 杂交(Western blotting ),三种分子杂交技术的比较,Southern,Northern,Western,五、原位杂交(in situ hybridization),将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。 特点 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究 不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高 能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态,细胞或组织的固定后置于载玻片上 组织细胞杂交前的预处理 用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质 探针的选择和标记 杂交 杂交结果检测,基本步骤,菌落或噬菌斑杂交，将生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑按照其原
14、来的位置不变地转移到滤膜上，并在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用,基本程序是：将被筛选的大肠杆菌菌落或噬菌斑，从其生长的琼脂平板中转移到硝酸纤维素滤膜上，进行适当的温育，保存原来的菌落平板作为参照，以便从中挑取阳性克隆。,复制平板和膜转印时应在平板和膜上的一侧做三个对应的标签,0.5MNaOH裂解细菌 酸中和 蛋白酶处理 漂洗细胞碎片 80烘烤,与32P-标记的探针杂交,放射性自显影,在参照平板上挑取目标阳性克隆（阳性菌落）扩大培养,菌落原位杂交,一、PCR技术,聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，利用单链寡核
15、苷酸引物对特异DNA片段进行体外扩增的一种方法,Applied Biosystems GeneAmp PCR 9700 Thermocycler,第四节 聚合酶链式反应技术,二、PCR技术基本原理和操作,类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物,基本反应步骤,变性,退火,延伸,变性,1.PCR技术基本原理, 模板DNA的变性 模板DNA经加 热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备, 模板DNA与引 物的退火(复性) 模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DN
16、A单链的互补序列配对结合；, 引物的延伸 DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链,预变性,模板DNA dNTP 引物 Buffer,TaqDNA聚合酶,94oC5min,模板DNA dNTP 引物 Buffer,Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer,94 30s 55 1min 72 2.5min,Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer,72 710 min,循环2535次,第二轮扩增,第三轮扩增,第一轮扩增产物,目的基因,目的基因,PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈
