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1、年级：2012级 专业：麻醉学 实验课时间：第17周周一（2013年6月17日） 实验室：第三实验室 组别：第二实验组 组员：曹 毅（201206008 ） 徐 敏（201206009） 宁丽娟（201206010） 牛 钦（201206011） 潘雪婷（201206012） 薛 娟（201206013） 肖 璘（201206014） 张红娇（201206015） 报告人：,2012级 生物化学与分子生物学实验设计,案例 ： 患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。 体格检查：体温
2、38，脉搏150次/分，呼吸40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异常。实验室检查：红细胞 1.981012/L，血红蛋白53g/L，血清总胆红素85.5mol/L，结合胆红素13.7mol/L，未结合胆红素71.8mol/L，尿蛋白（+），潜血(+)，尿胆红素()，尿胆素原(+)，尿液镜下未见红细胞。,1. 根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿是何种疾病？（必答） 2. 请设计实验进一步明确诊断。（必答）要求：实验名称，实验方法，主要试剂和仪器，实验操作流
3、程及注意事项，结果如何分析。 3. 从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果。（必答） 4. 要想探讨该病发生的分子基础，可以用哪些技术检测什么目的基因？（选答） 5. 患者体型瘦小与该病症是否有关，为什么？（选答）,1. 根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿是何种疾病？,根据患儿的临床表现和体格检查，可初步判断该患儿患的是 G6PD（葡萄糖6磷酸脱氢酶）缺乏症 俗称蚕豆病,恶心、呕吐、面色苍白,皮肤及巩膜黄染,红细胞 1.981012/L,血红蛋白53g/L,血清总胆红素85.5mol/L,尿蛋白（+）,尿胆红素(),尿胆素原(+),尿液镜下未见红细胞,黄疸,红细胞膜不完整，
4、已破裂,红细胞含量少,含量明显增加,血红蛋白量减少,排尿呈酱油样色,游离胆红素增加,溶血性黄疸,肠肝循环增多,G6PD缺乏症的临床类型,蚕豆病 新生儿黄疸 药物性溶血 感染性溶血 非球形细胞溶血性贫血等,临床类型,G6PD缺乏症的临床表现,G6PD缺乏症的临床表现与一般溶血性贫血大致相同。但临床表现的轻重程度不同，多数患者，特别是女性杂合子，平时不发病，无自觉症状，部分患者可表现为慢性溶血性贫血症状。常因食用蚕豆、服用或接触某些药物、感染等诱发血红蛋白尿、黄疸、贫血等急性溶血反应。 因G6PD缺乏诱发的严重的急性溶血性贫血因红细胞破坏过多，如不及时处理，可引起肝、肾、或心功能衰竭，甚至死亡。,
5、蚕豆病的发病原因,发病原因:蚕豆病起病急剧，大多在进食新鲜蚕豆后12天内发生溶血，最短者只有2小时，最长者可相隔9天。如因吸入花粉而发病者，症状可在数分钟内出现。潜伏期的长短与症状的轻重无关。,蚕豆病的发病表现,症状有全身不适、疲倦乏力、畏寒、发热、头晕、头痛、厌食、恶心、呕吐、腹痛等。巩膜轻度黄染，尿色如浓红茶或甚至如酱油。一般病例症状持续26天。最重者出现面色极度苍白，全身衰竭，脉搏微弱而速，血压下降，神志迟钝或烦躁不安，少尿或闭尿等急性循环衰竭和急性肾功能衰竭的表现。如果不及时纠正贫血、缺氧和电解质平衡失调，可以致死；但如能及时给以适当的治疗，仍有好转希望。 （以上内容引自百度百科）,2
6、.请设计实验进一步明确诊断 （要求：实验名称，实验方法，主要试剂和仪器，实验操作流程及注意事项，结果如何分析。),高铁血红蛋白还原试验 G6PD荧光斑点试验 红细胞G6PD活性测定,筛选试验,确诊试验,一、高铁血红蛋白还原试验,【实验原理】在全血中加入亚硝酸钠，使红细胞中的亚铁血红蛋白氧化为高铁血红蛋白（MHb）,高铁血红蛋白在高铁血红蛋白还原酶的作用下又被还原为亚铁血红蛋白。在这过程中，高铁血红蛋白还原酶不仅需要亚甲蓝作为递氢体，还需要由G6PD参与磷酸戊糖途径形成NADPH作为辅酶才完成上述反应。所以，G6PD缺陷症的患者其MHb还原率下降（分光光度技术）,【主要试剂】 0.18mol/L
7、亚硝酸钠-葡萄糖溶液、 0.4mmol/L亚甲蓝溶液 、0. 28 mol/ L 葡萄糖溶液、混合液 （等量+）、生理盐水、抗凝剂,【实验仪器】 紫外分光光度计水浴箱、离心机、试管3支,【实验流程】,取静脉血1. 8mL 于抗凝管，混匀 抗凝管(含0. 2 mL109 mmol/ L抗凝剂+葡萄糖20 mg),离心沉淀 1000 r/ min 15 min,调整 血细胞血浆=11 ，混匀 调整后全血（备用）,1ml 0. 18 mol/ L 亚硝酸钠 1ml 0. 28 mol/ L 葡萄糖溶液 混匀 混合试剂（备用） 1ml 0.14 mmol/ L 亚甲基蓝液,【实验流程】,取试管3 支,
8、标上A、B、S ,按下表加入试剂,高铁血红蛋白还原实验操作步骤,混合试剂/ mL 0. 01 / / 生理盐水/ mL / 0. 01 / 0. 18 mol/ L 亚硝酸钠- / / 0. 01 0. 28 mol/ L葡萄糖溶液/ mL 经调整的全血/ mL 0. 1 0. 1 0. 1 来回摇动1520 次,置37 水浴箱静置3 h 蒸馏水 10. 00ml 10. 00ml 10. 00ml,试剂 A B S,B管为空白管, 在波长635 nm处，测定“A”管及“S”管吸光度,计算高铁血红蛋白还原率 公式：MHb % = (1 - A/ S) 100 %,【实验流程】,二、G6PD荧光
9、斑点试验,【实验原理】葡萄糖-6-磷酸（G6P）在G6PD作用下形成6-磷酸葡萄糖（6PGA）,同时使NADP转变为NADPH,后者在340nm波长紫外线照射下产生荧光（反应原理如下图）。所以将含有G6P和NADP等的混合试剂与血混匀后在0分钟、5分钟、10分钟分别取1滴血到滤纸上，通过观察滤纸上有荧光出现时间可判断G6PD活性,NADP NADPH,G6P 6PGA,G6PD,【主要试剂】反应液：G-6-P液1份、NADP液1份、皂素2份、磷酸盐缓冲液3份和蒸馏水3份混匀,【主要仪器】长波紫外灯、滤纸、水浴箱,取试管，加10l全血+100l反应液，混匀， 取一滴于滤纸上（第一斑点 ）作为对照
10、,将上液置于37水浴10min ，再 取一小滴滴于滤纸上（第二斑点）实验组,晾干后，于长波紫外灯下（365nm）观察结果，计时,根据结果作出相应诊断,【实验流程】,三、红细胞G6PD活性测定,【实验原理】基本原理同G6PD荧光斑点实验。不同的是利用紫外光分光光度法定量测定酶活性，即每隔一分钟在340nm波长测定孵育液中NADPH吸光度（测6次），求每分钟吸光度增加的平均值，根据单位时间内NADPH生成由于所用试剂及体系的不同。 方法：WHO推荐的Zinkham;NBT定量法等,【主要试剂】生理盐水、溶血素 、3.8mmol/L NADP 、0.5mol/L Tris缓冲液（pH7.5） 、0.
11、63mol/L氯化镁溶液 、33mmol/L G-6-P液,【主要仪器】紫外分光光度计水浴箱、离心机、试管,取抗凝血2ml，生理盐水洗涤红细胞3次（1500r/min离心 10min）,除去上清液和乳白层（白细胞和血小板） 加等体积生理盐水红细胞悬液,红细胞悬液0.05ml+溶血素0.5ml，混合，放置10min 溶血液 并测定其Hb浓度,进行比色 （见下表）,【实验流程】,G-6-PD活性测定的操作表（Zinkham法 ),试管 对照管 测定管,NADP液（ml） 0.1 0.1 Tris液（ml） 0.1 0.1 氯化镁液（ml） 0.1 0.1 蒸馏水（ml） 0.68 0.58 G6P
12、液（ml） 0.1 37预热 溶血液（l） 20 20,立即340nm处测吸光度，以对照管调零，37恒温，每分钟观察1次，记录吸光度的变化,【实验流程】,计算公式：G-6-PD活性（U/gHb） =A/min1000/6.221020/20 Hb(gL-1),A/min:每min吸光度的平均变化值 1000/6.22:为微摩尔消光系数 1020/20:总容量与溶血液的量之比；,【实验流程】,注意事项,（1）受检者红细胞比容对结果有一定影响，比容低于30%时，高铁血红蛋白还原率可明显降低故贫血患者应先调整红细胞比容后再测定。 （2）抗凝剂以38g / L柠檬酸或输血时用的抗凝剂ACD为好，血液标
13、本可保存1周左右。肝素抗凝剂可用（每毫升血液用肝素0.5mg），但标本只能保存3天。草酸盐抗凝不适于本法。 （3）ACD抗凝剂不宜太多，血液与ACD抗凝剂按1:0.15混合即可，否则可因PH降低，而使高铁血红蛋白还原速度减慢，以致出现假阳性。,结果分析方法,一、高铁血红蛋白还原试验： 正常值：MHb还原率=75%，脐血=77% 临床诊断：纯合子和半合子（XY）患者： MHb还原率 30% 脐血 40% 杂合子患者： MHb还原率 31%74% 脐血 41%76%,二、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶荧光斑点试验 正常人： 0min斑点无荧光，5-10min出现， 10min荧光最强 临床诊断： 轻度缺陷
14、者：0-10min荧光很弱或不出现 中度缺陷者：10-30min出现荧光 严重缺陷者：30min内不出现荧光,结果分析方法,三、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性测定 G6PD缺陷者：G6PD活性较正常平均值低40%以 上即可作出诊断,方法 正常值范围,WHO推荐的Zinkham (12.012.09)IU/gHb(37) ICSH推荐的Glock与McLoan法 （8.341.59）IU/gHb(37) NBT定量法 （13.130.0）NBT单位 Chapman和Dern法 （2.87.31）IU/gHb(25),结果分析方法,必答题一： 从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果。,（1）急性贫血、溶血：因G6PD基因的缺陷不能提供足够的NADPH以维持还原型谷胱甘肽（GSH）的还原性（抗氧化作用），在遇到蚕豆中某种因子后更诱发了红细胞膜被氧化，红细胞膜上的磷脂分子中的不饱和脂肪酸氧化生成过氧化脂质，损害细胞膜。G6PD有保护正常红细胞免遭氧化破坏的作用，新鲜蚕豆是很强的氧化剂，当G6PD缺乏时则红细胞被破坏而致病。,A AH2 2GSH GSSG + + NADH
