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1、,齐齐哈尔医学院免疫教研室,第八章,荧光免疫试验 Fluoroimmunoassay,掌握：荧光的基本知识；荧光抗体染色与结果判断。 熟悉：荧光物质。 了解：荧光抗体的制备；荧光显微镜的基本结构；荧光免疫分析；荧光免疫技术的应用。,教学目的,第一节 荧光免疫试验的组成因素 第二节 间接免疫荧光试验 第三节 流式荧光免疫试验 第四节 其他与荧光检测相关的免疫试验 第五节 荧光免疫试验的临床应用 第六节 影响荧光免疫试验的主要因素,荧光免疫试验（fluoroimmunoassay): 以荧光物质标记抗体和抗原，通过与相应抗原或抗体发生特异性结合反应，以此对待测物进行定位、定性和定量分析的检测技术，
2、具有高度特异性、敏感性和直观性，是最早出现的免疫标记技术。,荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为荧光。,第一节 荧光免疫试验的组成要素,吸收能量,激发态,基态,荧光效率,荧光特点： 1 可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光； 2 一旦停止供能，荧光随之瞬间消失；,(一)荧光的基本知识 1.发射光谱:指固定激发光波长，在不同波长下记录到的标本发射荧光的谱图。 2.激发光谱:指固定检测发射光波长，用不同波长的激发光照射标品得到的荧光的谱图。,一 荧光及荧光物质基础知识,荧光效率 ,吸收光的光量子数（激发光强度）,发射荧光的光量
3、子数（荧光强度）,荧光色素本身的物理特性,激发光强度及激发光波长,决定于,决定于,3.荧光物质将吸收的光能转变成荧光的百分率 -荧光效率,定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间。 各种荧光物质的荧光寿命不同。,4.荧光寿命,5.荧光淬灭:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。 如紫外线照射、高温（20）、苯胺、酚、硝基苯、I-等 。,如何避免： 勿长时间照射 脉冲瞬间照射 避光保存,猝灭剂：具有荧光猝灭作用的物质,荧光淬灭,（二）荧光物质,荧光显微镜,利用一定波长的激发光对待测标本进行激发，产生一定波长的荧光，对组织细胞结构或其组分进行定性、定位
4、和半定量分析检测。,二、荧光显微镜,隔热滤光片： 位于灯室聚光器前， 作用阻断红外线通过而隔热。 激发滤光片： 位于光源和物镜之间， 作用能选择性地透过紫外线可 见波长的光域，提供合适的激发光。 吸收滤光片： 位于物镜和目镜之间， 作用阻断激发光而使发射的荧 光透过，保护眼睛。,荧光显微镜,滤光片,透射光：照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜。 落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经标本反射进入物镜。,透射荧光显微镜光路(a),落射荧光显微镜光路(b),荧光显微镜,光路,1、抗体要求,高特异性 高亲和力 经纯化提取IgG,三、荧光素-抗体结合物,有能与蛋白质形成共价健的化学基团
5、 荧光效率高， 荧光色泽与背景组织的色泽对比度高。 与蛋白质结合后不影响蛋白质原有性质。 标记方法简单、安全无毒。 与蛋白质的结合物稳定，易于保存。,2 荧光素要求,一、基本原理,特异性抗体与相应抗原反应，荧光素标记的抗抗体再与第一抗体结合。,间接荧光抗体染色法示意图,第二节 间接免疫荧光试验,间接免疫荧光法示意图,间接法： 优点：敏感度高于直接法 制备一种荧光抗体可检测多种抗原 既可用于检测抗原，也可检测抗体 缺点：易出现非特异性荧光 方法较麻烦 操作时间较长 应用：自身抗体的检测,标本片上滴加特异性抗体 3730min PBS洗涤 滴加二抗 3730min PBS洗涤 镜检,二、实验方法,
6、三、注意事项,1.荧光染色时间：一小时内或28保存4小时， 2.三种对照：阳对：阳性血清+荧光标记物 阴对：阴性血清+荧光标记物 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物 3.标本片需保持湿润，避免干燥 4.滴加抗体或荧光标记物,始终保持在未知抗原标本上,-：无或仅见极微弱荧光。 +：荧光较弱但清楚可见。 + ：荧光明亮。 +：耀眼强荧光。 特异荧光强度+以上判定为阳性，对照光应呈-或。 根据+的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。,荧光抗体染色及结果判断,第三节 流式荧光免疫试验,流式荧光免疫试验(flow cytometry and fluorescence immunoassay): 采用人工微
7、球和流式检测方式对可溶性物质进行高通量分析的检测方法。 悬浮阵列；流式微球阵列,第四节 其他与荧光检测相关的免疫试验,其他荧光免疫试验,时间分辨荧光免疫测定,荧光酶免疫测定,荧光偏振免疫测定,自发荧光寿命短:1ns10ns 镧系元素寿命长:10s1000s 短寿命荧光完全衰变后再测定镧系元素特异荧光,（一）基本原理,时间分辨检测原理示意图,1.时间分辨,一、时间分辨荧光免疫测定,2.stokes位移:激发光谱和发射光谱的波长差。 stokes位移小，相互干扰，影响结果准确性。 镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光谱和发射光谱不重叠,时间分辨荧光免疫测定,发射光谱带较窄：613nm1
8、0nm，干扰少 激发光谱带较宽：300nm350nm，灵敏度高,3.发射光谱和激发光谱,时间分辨荧光免疫测定,4.荧光标记物的相对比活性 比活性 ：单位时间内每个标记分子 可被探测到的信号量。 Eu3+螯合物 反复激发 1000次/秒 大大提高了荧光标记物比活性,时间分辨荧光免疫测定,结合-二酮体,Eu3+解离,酸性增强液,荧光增强,Eu3+标记抗原抗体复合物,5.信号增强,时间分辨荧光免疫测定,（二）标记物和标记方法,时间分辨荧光免疫测定,（三）方法类型,双抗体夹心法 固相抗体竞争法 固相抗原竞争法,时间分辨荧光免疫测定,（三）方法类型,时间分辨荧光免疫测定（双抗体夹心法）示意图,灵敏度高：
9、最小检出量10-18mol/L 分析范围宽：45个数量级 标记物稳定：有效使用期长 测量快速，易自动化 易受污染，本底增高,方法评价,时间分辨荧光免疫测定,光线通过偏振滤光片后，形成一个方向的平面光称为偏振光。,偏振荧光(绿光,525nm550nm),偏振光(蓝光,485nm),荧光物质,二、荧光偏振免疫测定,抗原抗体竞争反应 AgF分子小，转动速度快，偏振荧光弱 AgF-Ab分子大，转动速度慢，偏振荧光强 若待检抗原多，则AgF-Ab少，AgF多，偏振荧光弱 待检抗原含量与偏振荧光强度成反比,荧光偏振免疫测定原理示意图,基本原理,方法评价,样品用量少 荧光素标记试剂稳定，使用寿命长 重复性好
10、 快速，易自动化 适于小、中等分子物质检测 灵敏度较非均相荧光免疫测定法低,荧光偏振免疫测定,第五节 荧光免疫试验的临床应用,1.血清中自身抗体检测,抗核抗体(均质型),抗核抗体(核膜型),抗核抗体(斑点型),一、间接免疫荧光试验,2.各种微生物的快速检查和鉴定,寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）,细菌（藤黄微球菌 ),一、间接免疫荧光试验,肿瘤（人肝癌细胞）,间接免疫荧光试验,3、寄生虫感染的诊断 4、白细胞分化抗原的检测 5、人类白细胞抗原的检测 6、肿瘤组织中肿瘤标志物的检测 7、激素和酶的组织定位,（一）时间分辨荧光免疫试验,二、其他荧光免疫试验,1.内分泌学中的应用 2.肿瘤学中的应用 3
11、.免疫学中的应用 4.分子生物学的应用 5.微生物学中的应用,（二）荧光偏振免疫试验,第六节、影响荧光免疫试验的主要因素,一、荧光素-抗体结合物 二、待检标本 三、其他,荧光素-抗体结合物的结合比率： F/P=,一、 荧光素-抗体结合物,抗体效价：双向免疫扩散试验,抗体纯度：高亲和力、单克隆抗体 抗体特异性：吸收试验、抑制试验,荧光素与蛋白质结合的比率（F/P） -荧光素结合到抗体蛋白上的量 是标记抗体质量鉴定的重要指标 F/P值越高，说明抗体分子上结合的荧光素越多,组织标本：冷冻切片、石蜡切片和印片 细胞标本：涂片、爬片 细菌标本：涂片、爬片,二、待检标本,（一）反应时间和温度 时间：10min30min （二）荧光抗体的保存 -20： 保存2-3年 真空干燥：长期保存,三、 其他,间接免疫荧光试验,其他荧光免疫试验,荧光免疫技术,时间分辨荧光免疫测定,荧光偏振免疫测定,小 结,1 荧光效率是（ ） A 荧光素产生荧光的强度 B 荧光素将吸收的光能转变为荧光的百分率 C 物质产生荧光的效率 D 特异性荧光和非特异性荧光的强度比 E 荧光素接受激发光后，产生的荧光色调 2 最早出现的免疫标记试验是（ ） A 放免 B 荧免 C 酶免 D 化学发光免疫 E 胶体金免疫,
