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1、第四章 发酵工程的灭菌 和空气除菌,在当前的发酵工业中，绝大多数的发酵过程属于需氧的纯种发酵。 发酵过程中需要不断通入无菌空气以满足微生物生长及合成代谢产物的需要。 在整个发酵系统内存活的生物体只有需要培养的微生物，如果在发酵系统内除了需要培养的微生物以外，还有其他微生物存活，这种现象称为染菌。 染菌会给发酵带来很多负面影响，轻则影响产物的产量，或使产物的提取变得困难，造成产品质量下降或收率降低，重则导致产物全部损失，所以染菌是工业发酵的“大敌”。 发酵使用的培养基、发酵设备、空气过滤器、附属设备、管路、阀门以及通入罐内的空气，在使用前均需彻底灭菌或除菌，这是防止发酵过程染菌、确保正常生产的关
2、键。,本章内容,第一节 常用的灭菌方法 第二节 培养基与发酵设备的灭菌 第三节 空气的除菌,在工业发酵中，发生杂菌污染会产生以下不良后果： 营养物质和产物会被杂菌消耗而损失； 杂菌产生的毒性物质和某些酶类会抑制生产菌株的生长； 杂菌的代谢产物改变发酵液的某些理化性质(如溶解氧、黏度、pH) ，抑制产物的生物合成； 污染的杂菌和产生的某些酶类会分解或破坏已经合成的产物； 使产物提取变得困难，造成产率降低或使产品外观及内在质量下降； 发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解而使生产失败。,因此防止染菌是任何发酵的一项重要工作内容，必须牢固树立无菌观念，特别强调无菌操作： 发酵设备、空气过滤器、附属设备、管
3、路、阀门应严格密闭，整个系统要维持高于环境的压力，使用前应经过彻底灭菌； 培养基和培养过程中加入的物料应经过彻底灭菌； 通入罐内的空气应经彻底除菌处理； 使用无污染的种子等。 这是防止发酵过程染菌、确保正常生产的关键。,第一节 常用的灭菌方法 第二节 培养基与发酵设备的灭菌 第三节 空气的除菌,一、常用灭菌方法,第一节 灭菌和除菌的基本原理,灭菌：是利用物理或化学的方法杀灭或去除物料或设备中所有的有生命的有机体的技术或工艺过程。 消毒：是采用较温和的理化方法，仅杀死对人体有害的病原微生物的过程。 消毒只能杀死营养细胞而不能杀死芽孢或孢子。 除菌：是指用过滤方法除去空气或液体中所有的微生物及其孢
4、子。,防腐：就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。如： 低温，缺氧，干燥，高渗，高酸度，防腐剂。 化疗即化学治疗：是利用具有高度选择毒力（即对病原微生物具有高度毒力而对宿主无显著毒性）的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该传染病的一种措施。 用于化疗目的的化学物质称化学治疗剂。最重要的化学治疗剂如各种抗生素、磺胺类药物和中草药中的有效成分等。,发酵工业生产中常用的灭菌方法： 化学物质灭菌、 热灭菌 辐射灭菌 过滤介质除菌 臭氧（O3）灭菌,干热灭菌 湿热灭菌,高温灭菌,干热灭菌法,火焰灼烧法 热空气灭菌法,湿热灭菌法,常压灭菌
5、,高压灭菌,巴氏消毒法 煮沸消毒法 间歇灭菌法,高压12120min； 低压10530min。,低温长时间(LTLT,6265,30分钟)，现在殆不存在， 高温短时间(HTST,7275,15秒)，能杀灭牛乳中之所有病原菌，在欧美主要被使用。 超高温加热瞬时法(UHT法 ，135150、26秒) ，而成为今日牛乳杀菌法的主流，此有牛乳中乳清蛋白增进变性之虞。 达到杀菌与保质，缩短时间，提高经济效益。,二、工业生产中的灭菌 1、工业上具体措施包括 （1）使用的培养基和设备须经灭菌； （2）好氧培养中使用的空气应经除菌处理； （3）设备应严密，发酵罐维持正压环境； （4）培养过程中加入的物料应经过
6、灭菌； （5）使用无污染的纯粹种子。 2、培养基灭菌的目的 杀灭培养基中的微生物，为后续发酵过程创造无菌的条件。 3、培养基灭菌的要求 （1）达到要求的无菌程度（10-3） （2）尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中，培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的： 培养基中不同营养成分间的相互作用； 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。,1、化学物质灭菌 原理：某些化学药剂能与微生物细胞中的某种成分产生化学反应，如使蛋白质变性、酶类失活、破坏细胞膜透性而具有杀菌或消毒的作用。 常用的化学药剂：甲醛、氯(或次氯酸钠)、高锰酸钾、环氧乙烷、苯酚、季氨盐(如新洁尔灭)、氯化汞等。 适用情况：
7、因培养基里含有蛋白质等营养物质亦易与上述化学物质发生化学反应， 同时药物加入培养基之后很难除掉。 适合于局部空间或某些器具的消毒，但不适合用于培养基的灭菌。 使用方法：根据灭菌对象的不同有浸泡、添加、擦拭、喷洒、气态熏蒸等。,第一节 常用的灭菌方法,2、臭氧（O3）灭菌 臭氧是一种强氧化剂，灭菌过程属生物化学氧化反应。原理是： 臭氧在常温、常压下分子结构不稳定，很快自行分解成氧气（O2）和单个氧原子（O）；后者具有极强的氧化作用，能氧化分解细菌内部氧化葡萄糖所必须的酶，从而破坏其细胞膜，将它杀死； 直接与细菌、病毒作用，破坏它们的细胞器和DNA、RNA，使细菌的新陈代谢受阻，导致细菌死亡； 作
8、用于细胞外膜的脂蛋白和内部的脂多糖，使细菌发生通透性畸变而溶解死亡。,我国在GMP验证过程中人们大力推荐臭氧灭菌方法。臭氧灭菌有许多特点： O3为气体，能迅速弥漫到整个灭菌空间，灭菌无死角，浓度分布均匀。 臭氧灭菌为溶菌级方法，杀菌彻底。杀菌能力与过氧乙酸相当，高于其它消毒剂。 杀菌广谱，可杀灭细菌繁殖体和芽孢、病毒、真菌等， 并可破坏肉毒杆菌毒素。另外，O3对霉菌也有极强的杀灭作用。 臭氧制备是利用我们周围的大气制取(现有成型产品：臭氧发生器），现制现用，不需储藏设施，节省原料储储所需的占地面积。,臭氧分解形成的单个氧原子（O）则会自行重新结合成为普通氧分子（O2），不存在任何有毒残留物，没
9、有二次污染，故称无污染消毒剂(绿色消毒剂)。 臭氧灭菌在药品生产中具有广泛的用途。 对管道容器的灭菌； 与HVAC相结合，利用中央空调净化系统对洁净区的灭菌； 对原辅助材料和工作器具的灭菌； 对密闭空间的灭菌； 对药厂用水的灭菌处理。,3、辐射灭菌 辐射灭菌是利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀灭微生物。 射线、X射线、射线、射线、紫外线、超声波等从理论上讲都能破坏蛋白质，破坏生物活性物质，从而起到杀菌作用。 X射线、射线，波长0.11.4，含有极高的能量，使菌体内的水和有机物产生强烈的离子化反应，产生自由基，进一步与氧作用，产生一些具强氧化性的过氧化物，如HO2 、H2O2，使细胞内某些蛋白质
10、和酶发生变化，阻碍微生物的代谢活动而导致菌体损伤或迅速死亡。 X射线的穿透力极强，但不经济，并且向四面八方辐射，不适于发酵生产使用。,紫外线波长为21003100的紫外线有灭菌作用，最常用的波长2537的紫外线。 主要是与菌体核酸发生光化学反应而造成菌体死亡。 紫外线对微生物菌体和芽胞均有杀灭作用，有高度致死效果。但紫外线的穿透力很低，仅适用于表面和局部空间灭菌，如台面、洁净室、更衣室等。 现在，紫外线常与HVAC相结合用于气相循环消毒。 HVAC是Heating, Ventilation and Air Conditioning 的英文缩写，就是空气调节系统，是包含温度、湿度、空气清净度以及
11、空气循环的控制系统。,4、静电除菌 静电除菌是利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘灭菌的目的。原理是，悬浮于空气中的微生物，其孢子大多数带有不同的电荷，没有带电荷的微粒进入高压(1000V/cm2)静电场时都会被电离成带电颗粒，受静电场库仑力的作用，向极板移动，吸附在极板上，得到净化的气体排出除尘器外。,空气进,空气出,钢丝电晕电极,钢管沉淀电极,+,+,优点：阻力小，约0.01MPa； 除水、除油的效果好 耗电少，每处理1000m3的空气每小时仅耗电0.20.8KW。 缺点： 静电除菌效果不是很高，一般在8599%之间； 当捕集的微粒积聚到一定厚度时，极板电压下降，微粒的吸附力减弱甚至随气流
12、飞散，这时除菌效率很快下降。一般当电极板上尘厚1mm时，就应该用喷水管自动喷水清洗，洗净干燥后重新投入使用。 对于一些直径很小的微粒，它所带的电荷很小，当产生的引力等于或小于微粒布朗扩散运动的动量时，则微粒就不能被吸附而沉降，所以静电除尘灭菌对很小的微粒效率较低。 设备庞大 、一次性投资较高。,由于除菌效率不高，往往需要与高效空气过滤器联合用于洁净工作室空气除菌；或用于洁净工作台。,5、介质过滤除菌 要去除液体或气体中的微生物以达到无菌要求，可以使用适当的材料进行过滤，这种方法只能用于澄清流体的除菌。工业上主要用于热敏性物质(氨水、丙醇等)和空气的除菌。 按过滤除菌机制不同而分为 两者原理是不
13、同的，绝对过滤介质间的空隙小于颗粒直径，是靠表面拦截作用除去菌体；而深层过滤介质间的空隙远大于颗粒直径。是靠微生物微粒与滤层纤维间产生惯性冲击、拦截、扩散、重力沉降及静电吸附等作用，将其中的尘埃和微生物截留、捕集在介质层内，达到过滤除菌体目的。,绝对过滤 深层过滤,6、物理法 干热灭菌法 ：灼烧灭菌法；玻璃器皿、金属器材和其他耐高温的物品在干热灭菌器中，于160下保存1h。有纸或棉塞者灭菌不能超过170。 射线灭菌法：利用紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的射线进行灭菌的方法，波长范围在200275nm的紫外线具有杀菌作用，杀菌作用最强的范围是250 270nm，波长为253.7nm的紫外线杀
14、菌作用最强。在紫外灯下直接暴露，一般繁殖型微生物约3 5min，芽孢约10min即可杀灭。但其穿透力较差，一般只适于接种室、超净工作台、无菌培养室及物质表面杀菌。不同微生物对紫外线的抵抗力不同，对杆菌杀灭力强，对球菌次之，对酵母菌、霉菌等较弱，因此常与化学灭菌结合使用。 过滤除菌：使用适当的过滤材料或介质对液体或气体进行过滤，出去微生物的方法。主要适用于：热敏感物质（生长因子、抗生素、培养基）的灭菌和发酵用无菌空气的制备。,湿热灭菌法：利用饱和蒸汽进行灭菌。释放大量热量和强大穿透力使生物大分子化学键受到破坏。常用于培养基、发酵设备、附属设备、管道和实验器材的灭菌。 煮沸灭菌法：将物品在水中煮沸
15、15-20min，一般微生物细胞可杀死，但不能杀死孢子。适用于食品、器具消毒。无芽孢菌用60 10min，芽孢用100 10min，嗜热细菌用120 20-30min可完全杀死。 巴氏消毒法：有的食物经煮沸或用更高的温度处理会损害它的营养价值或色香味，则采用巴氏消毒，已达消毒和防腐目的。60-62 30min或70 15min，以杀死其中的病原菌或部分微生物的营养体。适用于牛奶、啤酒、黄酒酱油、醋等食品。 间歇灭菌法：反复几次的常压蒸汽灭菌，已达到杀死微生物营养体和芽孢的目的。100 30-60min而杀死微生物营养体，置37 培养1h，使其芽孢发育成营养体，次日再同样的方法处理，反复3次。适
16、用于不能高压灭菌的物质，如糖类明胶牛奶培养基等。 高压蒸汽灭菌：使用密闭的高压蒸汽灭菌锅。实验室常用压力为0.1兆帕（MPa，一公斤的压力），121 15-30min，可杀死各种微生物及芽孢。常用于培养基、发酵设备、管道、实验器材等。,湿热灭菌原理,灭菌不利方面,由于蒸汽具有很强的穿透能力，而且在冷凝时会放出大量的冷凝热，很容易使蛋白质凝固而杀死各种微生物。,会破坏培养基中的营养成分，甚至会产生不利于菌体生长的物质。因此，在工业培养过程中，除了尽可能杀死培养基中的杂菌外，还要尽可能减少培养基中营养成分的损失,第二节 培养基与发酵设备的灭菌,一、灭菌的机理 （一）化学灭菌机理：化学物质（高锰酸钾、漂白粉等）与微生物细胞中的某些成分产生化学反应，如蛋白质变性、核算的破坏、酶的失活、细胞膜头型的改变而杀死微生物。 （二）紫外线灭菌机理：在紫外线照射下微生物细胞的DNA遭到破坏，形成胸腺嘧啶二聚体和胞嘧
