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1、是植物离体培养中的营养和能量来源，也是人们调节和控制培养物生长发育的重要因子。 是离体培养组织或细胞赖以生存的营养基质，是为离体培养材料提供的近似生物体内生存的营养环境。,第三节 培养基及其配制,这些必需元素在生物体内的生理作用重要有四方面： 组成各种化合物，参与有机体的构造，成为结构物质； 构成一些特殊的生理活性物质，参与活跃的生理代谢； 元素间的相互协调，维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等电化学方面的作用； 调节形态发生和组织器官的建成。,在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求，它们才能很好地
2、生长。,因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。,第三节 培养基及其配制,一、培养基成分 二、培养基种类 三、培养基的配制方法,一、培养基成分,1. 无机元素（大量元素、微量元素） 2. 有机元素（氨基酸、维生素、糖类） 3. 植物生长调节物质 4. 琼脂 5. 水,1. 无机元素,无机营养对植物的生长发育十分重要。一旦无机元素供应不足，组织培养材料就会出现一定的缺素症状，如植株失绿、细胞分裂停止、细胞分化受阻等；但营养过多，也会造成植物细胞代谢障碍，生长抑制等毒害现象。,大量元素,培养基中无机元素用量差异较
3、大，可分为大量元素类和微量元素类。 指使用浓度大于0.5mmolL的元素，有碳、氢、氧、氮、钾、磷、镁、硫、钙等。,无机元素的作用,N：是各种氨基酸、维生素、蛋白质、和核酸的重要组成成分，在制备培养基时以NO3和NH4两种形式供应。 P：是磷脂的主要成分。常用的物质有KH2P04或NaH2P04。 K：对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。制备培养基时，常以KCI、KN03等盐类提供。,Mg、S和Ca： Mg是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；S是含S氨基酸和蛋白质的组成成分。它们常以MgSO47H20 提供。Ca是构成细胞壁的一种成分，Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用
4、，常以CaCl22H2O提供。,2.微量元素：指使用浓度小于0.5mmolL的元素 主要有Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等。,铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。同时，它又是叶绿素形成的必要条件。培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。在制做培养基时不用硫酸铁，和FeCl3(因其在pH值52以上，易形成Fe(OH)3的不溶性沉淀)，而用FeSO47H20和Na2EDTA结合成螯合物使用。,B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长、发育异常现象。,2. 有机元素（氨基酸、维生素、糖类,氨基酸类 维生素类 糖类
5、 天然有机添加物,是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。,氨基酸类,维生素类,这类化合物主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。 VB1对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，VB6能促进根的生长，Vpp与植物代谢和胚的发育有一定关系。Vc有防止组织变褐的作用。,主要有VBl(盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇)、Vpp(烟酸)、Vc（抗坏血酸）、有时还使用生物素、叶酸、VB12等。一般用量为0.11.0mgL。,糖类,是培养基的主要碳源，为细胞提供合成新化合物所需的
6、碳骨架，并为细胞呼吸代谢提供底物与能源，维持一定的渗透压。,最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源，可支持许多组织很好的生长。蔗糖使用浓度在2%3%，常用3%高压灭菌时，一部分糖会发生分解，制定配方时要给予考虑。在大规模生产时，可用食用的绵白糖代替。,肌醇又叫环己六醇,在糖类的相互转化中起重要作用，是培养基 中不可缺少的有机营养。它可以形成果胶物质，是细胞壁的构建物质；还可以与6分子磷酸残基结合形成植酸。植酸与钙、镁等阳离子结合成植酸钙镁；植酸也可以形成磷脂，参与到细胞膜的组分中。,使用浓度一般为l00mgL，适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、
7、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。,天然有机添加物,是化学成分不明的复杂的营养混合物。尽管它们对细胞和组织的生长和分化有明显的促进作用，但因成分不定，质和量受多种因素的影响，实验的可重复性差，应尽量避免使用。常用的有机附加物有: 椰乳： 香蕉： 水解酪蛋白：,3. 植物生长调节物,植物激素是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等许许多多的生理生化活动，在培养基的各成分中，植物生长调节物是培养基的关键物质，对植物组织培养起着决定性作用。,3. 植物生长调节物,生长素类 细胞分裂素类
8、 赤霉素类 脱落酸 乙烯,在组织培养中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。在促进生长方面，根对生长素最敏感，在极低的浓度下，就可促进根生长，其次是茎和芽。天然的生长素热稳定性差，高温高压或受光条件易被破坏。在植物体内也易受到体内酶的分解。一般生长素浓度的使用为0.055mgL。,生长素类,IAA(吲哚乙酸)是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活力较低，是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小，高温高压易被破坏，也易被细胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。,NAA(萘乙酸)在组织培养中的起动能力要比IAA高出3-4倍，且由于可大批量人工合成，耐高温高
9、压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。,IBA(吲哚丁酸)是促进发根能力较强的生长调节物质。 2，4D(2，4二氯苯氧乙酸)起动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。,细胞分裂素类,细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖，而在生根培养时使用较少或用量较低。这类激素是腺嘌吟的衍生物，包括6BA(6苄基氨基嘌呤)、Kt (kinetin 激动素)、Zt (zeatin 玉米素)等，细胞分裂素0.0510mgL。 其中Zt活性最强，但
10、非常昂贵，常用的是6BA。,在培养基中添加细胞分裂素有三个作用： 诱导芽的分化促进侧芽萌发生长。 促进细胞分裂与扩大。 抑制根的分化。,生长素与细胞分裂素：它们的比例决定着发育的方向，是愈伤组织、长根还是长芽。如为了促进芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。,激素调控模式,生长素/细胞分裂素比例,高：有利于根的形成和愈伤组织的形成； 适中：有利于根芽的分化 低：有利于芽的形成,有20多种，培养基中添加的是GA3，主要用于促进幼苗茎的伸长生长，促进不定胚发育成小植株。此外，赤霉素还用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。一般在器官形成后，添加赤霉
11、素可促进器官或胚状体的生长。但赤霉素不耐热，水溶后不稳定，故应采用过滤除菌，并用酒精溶解。,赤霉素类,脱落酸,脱落酸 抑制蛋白质合成，抵消和抑制生长素、细胞分裂素和GA发挥作用。ABA诱导休眠，促进衰老和脱落。ABA不能高温高压灭菌，故应采用过滤除菌。,乙烯,乙烯具有促进果实成熟，促进脱落和衰老等作用，在组织培养中很少使用。,4. 琼脂,培养基有固体和液体两种。固体培养基最好的固化剂是琼脂，它是从海藻中提取的一种高分子多糖类物质，不提供任何营养成分。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40即凝固为固体状凝胶。通常所说的“煮化”培养基，就是使琼脂溶解于90以上的热水。,4. 琼脂,琼脂的用量在6
12、10g/l之间，若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的组织中去。若浓度过低，凝固性不好，新买来的琼脂最好先试一下它的凝固力。一般琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。,琼脂,加入琼脂的固体培养基与液体培养基相比优点在于操作简便，通气问题易于解决，便于经常观察研究等，但它也有不少缺点，如培养物与培养基的接触（即吸收）面积小，各种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分的充分利用，
13、同时培养物排出的一些代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。,其它,有玻璃纤维、滤纸桥、海绵等，总的要求是排出的有害物质对培养材料没有影响或影响较小。,5. 水,水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。它是生命活动过程中不可缺少的物质。配制培养基时尽量用蒸馏水或去离子水，以防成分变化。但大规模生产时可用自来水。,培养基的构成除了上述5种成分以外，有时还加入一些其他物质，如吸附用的活性炭、防止酚类污染的物质、抗生素等。另外培养的植物材料大多要求弱酸性环境，所以培养基在灭菌前需将PH调至5.65.8。当PH高于6时，培养基变硬，不利于培养物的生长；而PH低于5时，琼脂不能很
14、好地凝固。,抗生物质 抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在520mg/L之间。添加抗生物质可防止菌类污染，减少培养中材料的损失。对于刚感染的组织材料，可向培养基中注入5%10%的抗菌素。,活性炭,活性炭结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用通常使用浓度为0.5l0gL。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质。,活性炭的应用： 茎尖初代培养，可以吸附外植体产生的致死性褐化物，一般为0.1%0.2%，不能超过0.2%。 活性炭在生根时有明显的促进作用，可能是通过减弱光 照保护IAA。 降低玻璃苗的产生频率，对防止产生玻璃苗有良好作用，一般浓度为0.3%。,研究表示，每毫克的活性炭能吸
15、附l00ng左右的生长调节物质，这说明只需要极少量的活性炭就可以完全吸附培养基中的调节物质。大量的活性炭加入会削弱琼脂的凝固能力，因此要多加一些琼脂。很细的活性炭也易沉淀，通常在琼脂凝固之前，要轻轻摇动培养瓶。,活性炭的副作用,二、 培养基种类,根据培养基中无机盐的含量可分为4类，分别如下： 高无机盐含量培养基 较高硝酸钾含量培养基 中等无机盐含量培养基 低无机盐含量培养基,培养基种类,根据功能可分为以下几种： 诱导培养基 分化培养基 增殖培养基 生根培养基,培养基的名称，一直根据沿用的习惯。多数以发明人的名字来命名， 如hite培养基，urashige和koog培养基（简称 培养基），也有对
16、某些成分进行改良称作改良培养基。,而我们在做培养基时常说的基本培养基均是培养基的名称，如MS、B5、N6等。,MS基本培养基配方,在培养基配制时，为了使用方便和用量准确，并减少工作量，常将培养基成分首先配制成比需要浓度大若干倍的母液，然后在配制培养基时，再根据所需浓度按比例稀释。 因此培养基的配制包括母液的配制和培养基的配制。,三、培养基的配制,1. 培养基母液的配制 2. 培养基的配制,1. 培养基母液的配制,母液配制的目的 方便配置其他培养基； 保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取,培养基母液的配制,母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。配制时注意一些离子之间易发生沉淀，如a2和42，a2 、g2和43-一起溶解后，会产生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中。配制母液时要用蒸馏水或重蒸馏水。药品应选取等级较高的化学纯或分析纯。药品的称量及定容都要准确。各种药品先以少
