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1、聚合酶链反应技术（PCR）,2009.8,PCR具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍, 肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。,Mullis 1993年度诺贝尔化学奖。 PCR技术是一种利用DNA变性和复性原理在体外进行特定的DNA片段高效扩增的技术，可检出微量靶序列（1个copy）。在模板DNA、引物和dNTP存在的条件
2、下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。 仅需用极少量模板，在一对引物介导下，在数小时内可扩增至100-200万copy.,PCR(Polymerase Chain Reaction) Three steps: denaturation, primer annealing, polymerization. PCR反应分三步：变性、退火及延伸。,PCR技术的基本原理 其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 模板DNA与引物的退火：模板
3、DNA变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补配对结合； 引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补链，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24min，23h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,标准的PCR反应体系： 10Buffer 10ul dNTP mixture per 200umol/L primers per 10100pmol templete DNA 0.12ug DNA polymerase 2.5ul Mg2+ 1.5mm
4、ol/L dH2O 100ul,PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度,PCR 应用,遗传性疾病 地中海贫血的基因诊断 血友病 苯丙酮尿症,传染性疾病,肝炎 性病 肿瘤,法医学,个人识别、亲子鉴定 1985年，英国遗传学家Jeffreys采用DNA 指纹图谱进行个人识别和亲子鉴定。 有时犯罪物证量很少，不足以用来进行DNA指纹分析，PCR有效解决这些问题。对于犯罪现场中遗留的少量生物物证，如一根毛发、一滴血等都可用于分析，在法医学上认证罪犯、亲子鉴定以及人的性
5、别鉴定中PCR技术被普遍采用。,植物遗传育种,构建遗传图谱、分离目的基因、 基因定位 分子标记辅助育种 了解不同品种间的亲缘关系、系统进化,畜 牧,畜禽病诊断:猪口蹄疫病毒、猪瘟病毒、牛白血病毒、牛病毒性腹泻、免疫缺陷病毒等检测 性别鉴定：牛、绵羊Y染色体上特异 DNA片段 构建基因图谱 检测基因整合与表达：转基因鱼,植物保护,杀虫病原微生物的基因型鉴定 植物病原微生物分类 形态学上相似性和潜在的血清学交互反应，用常规方法难以区分，采用反转录PCR（RT-PCR）可准确快速区分,其他 考古学 植物分类学 群体生态学,实时定量PCR,Real-time Quantity PCR,定量PCR是在P
6、CR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术是一种在PCR反应体系中加入荧光基团利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板的定量而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点 。,作用原理,实时荧光定量PCR常用的检测模式： （1）TaqMan探针 （2）SYBR Green,TaqMan探针方法的作用原理:,原理：利用Taq 酶的53外切核酸酶活性并在PCR过程中反应体系加入一个荧光标记探针。 TaqMan探针5端标以荧光发射基团，3端标以荧光猝灭
7、基团。该探针在PCR过程中不能被延伸。当探针保持完整时，3端猝灭基团抑制5发射基团的荧光发射。,在PCR的退火期，探针与引物所包含序列内的DNA模板发生特异性杂交。延伸期引物在Taq酶作用下沿DNA模板延伸，当到达探针处，Taq酶发挥53外切核酸酶活性，继而发生置换，切断探针后，发射基团远离猝灭基团，荧光信号得到释放。 这时荧光探测系统便会检测到光密度增加。模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴有一个荧光信号的释放。,由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系，且光密度同释放的荧光基团的数目也成正比关系，因此该技术可对模板准确定量。由于扩增产物短时效率较高，故扩增长度一般为5015
8、0bp。,实时PCR技术原理,探针设计一般应符合以下条件：,(1) GC碱基含量在40%-60%。 （2） 避免单核苷酸序列的连续重复，尤其是G。 （3）避免5端为G， 因为G对荧光可能有抑制作用，尽量使C个数多于G。 （4）长度应在15-25个碱基左右，以保证结合的特异性。 （5）探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出约10 另外，探针与引物不能形成二聚体， 位置与上游引物尽量接近但不要重叠。,(2) SYBR Green I荧光染料的原理,SYBR Green I是一种只与双链DNA小沟结合的染料，当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。它的缺点是在于能与非特异性双链DNA（如引物二聚体）结合，但是其产生的干扰可能通过熔解曲线分析得到解决。,
