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1、医 用 化 学 实 验,生物化学教研室 张丽娜,实验课注意事项： 不迟到，不早退，做好课前预习工作 穿好白大褂 使用煤气时注意安全 试剂用后及时归位 保持严肃认真的实验态度 及时记录实验结果，按时完成实验报告,实验报告格式： 1、实验目的 2、实验原理 3、实验操作 4、实验结果（真实、客观） 5、讨论（实验报告的核心） 6、意见与建议（可选择）,实验一 医化实验基本操作,玻璃仪器的洗涤 吸量管的使用 注意：右手食指按住吸量管口 溶液的混匀 指弹混匀、搅拌混匀、倒转混匀、旋涡混合器混匀等,实验二 电离平衡与缓冲溶液,实验目的 1、掌握同离子效应的原理 2、学习通过韩-哈方程式配制缓冲溶液 3、
2、观察稀释对缓冲溶液pH值的影响 4、学习吸量管及pH计的使用,1、同离子效应,实验原理,HAc H+ + Ac-,NaAc Na+ + Ac-,例：,同离子效应使得HAc的电离度降低，溶液的pH升高,酸碱指示剂：,红,橙,黄,红,淡红,黄,无色,绿,蓝,3.1,4.4,8,10,6,7.6,甲基橙,酚酞,溴麝香草酚蓝,pH = pKa + lg,盐 酸,韩-哈方程式,也可表示为：,（盐的摩尔数） （酸的摩尔数）,n盐/V溶液 n酸/V溶液,当酸与盐混合前的浓度相等时：,= pKa + lg,V盐 V酸,pH,2、缓冲溶液,缓冲溶液加水稀释时，盐浓度与酸浓度作相同 比例稀释，因此，缓冲溶液的pH
3、几乎不因稀释 而改变。,缓冲溶液的缓冲能力有一定限度，超过该限度 缓冲溶液的pH也会发生较大改变,实验操作,1、同离子效应,（1）,各1支 + NH3 . H2O 2ml+ 1滴酚酞,1滴NH4Cl,1滴H2O,摇匀 观察结果,1ml=15滴,（2）,各1支 + 醋酸 2ml+ 1滴甲基橙,1滴NaAc,1滴H2O,摇匀 观察结果,2、缓冲溶液,（1）,测完pH值后2管保留,大试管3支,另取2支小试管，以上面试管2里的缓冲液进行实验,溴麝香草酚 蓝各1滴,（2）,（3）另取3支小试管，以上面试管2里的缓冲液进行实验,溴麝香草酚蓝各2滴，混匀,NaOH 3滴， 摇匀，观察结果 继续滴加，记录变色
4、时所加NaOH滴数,HCl 3滴， 摇匀，观察结果 继续滴加，记录变色时所加HCl滴数,2号管缓冲液测好pH后切勿立即倒去 吸量管的使用 pH计的使用,注意事项：,1、看清刻度，选择适当容量的吸量管 2、左手洗耳球，右手吸量管；食指按住管 口，稳住液面 3、拿吸量管的时候，刻度面向自己 4、读刻度时，眼睛与刻度线同一水平，以 下凹面为准 5、吸取另外一种试剂时，要润洗,吸量管的使用,实验三 功能基反应,实验目的,1、掌握几功能基的主要化学性质 2、了解乙酰乙酸乙酯的酮-烯醇互变异构现象,1、双键与卤素的加成反应,实验原理,红棕色的溴褪色，可用于鉴定有机物中 是否存在不饱和键,2、酚性羟基的反应
5、,（1）苯酚的弱酸性,可用于鉴别酚和醇,3、醛基的反应,O | R-C-H + 2Cu（OH）2,O | R-C-OH + Cu2O + 2H2O,砖红色沉淀,（班氏试剂）,酮无此反应，故可用于鉴别醛和酮,4、乙酰乙酸乙酯的酮-烯醇互变异构现象,使三氯化铁溶液呈紫红色反应具有烯醇式结构,与苯肼反应生成苯腙，颜色？,使红棕色溴的四氯化碳溶液褪色具有双键结构,O O | | CH3-C-CH2- C-O-C2H5,说明乙酰乙酸乙酯是酮式和烯醇式两种异构体的混合物，两者之间相互转变，处于动态平衡。,O O | | CH3-C-CH2-C-O-C2H5,OH O | | CH3-C = CH-C-O-
6、C2H5,室温时 酮型（93%） 烯醇型（7%）,凡两种或两种以上的异构体能互相转变，并以 动态平衡存在的现象互变异构现象,5、尿素的化学性质,OH-,紫红色物质,缩二脲反应：,缩二脲 + CuSO4（少量）,1、烯基的反应,实验操作,+ 硬脂酸10滴,+ 油酸10滴,+ 植物油10滴,逐滴加入5%Br2的CCl4溶液，不断振荡试管，记录结果,2、酚性羟基的反应,（1）,+ 液体苯酚2滴 水5滴，摇匀,+ 10%NaOH 2 滴 摇匀，观察,（2）,+ 0.5%苯酚溶液10滴,+ 0.5%水杨酸溶液10滴,+ 苯甲醇10滴,各加入1%FeCl3 1滴，观察结果,3、醛基反应（大试管6支）,试剂
7、（滴） 1 2 3 4 5 6 40%乙醛液 5 10%NaOH 5 丙酮液 4 1%葡萄糖 4 1%果糖 4 1%蔗糖 4 4 2mol/L盐酸 10 班氏试剂 10 10 10 10 10 ,1-5管于沸水中加热3分钟，观察结果；6号管加蒸馏水10滴，于沸 水中加热10分钟，不时振荡，再加10%NaOH10滴，班氏试剂10滴 混匀，于沸水中再加热3分钟，与5号管比较，记录结果,4、乙酰乙酸乙酯的酮-烯醇互变异构现象,（1）,+ 10%乙酰乙酸 乙酯2滴,+ 2，4-二硝基苯肼10 滴，振荡，观察结 果，写出反应式,（2）,+ 10%乙酰乙酸 乙酯10滴,+ 1%FeCl31滴，观察结果,再
8、加溴水1滴，观察变化，并加以解释,5、尿素的化学性质,+ 尿素1匙,小火加热，待尿素熔化,红色石蕊试纸放置管口，观察变化,继续加热,待管内物质凝固后冷却试管，加水2ml,玻棒搅动促溶，吸取上层溶液于另一试管中,再加入10%NaOH 、1%CuSO4各1滴，观察变化,注意事项,1、注意区分以下试剂： 液体苯酚5%苯酚溶液 5%Br2的CCl4溶液溴水 2 、液体苯酚预先加热，盛放其的试管也要预热 3、缩二脲反应中试管冷却后再加水，并用玻棒 轻轻搅动 4、挥发性试剂全部摆放在边台上，用后及时归位,实验三 动物组织中核酸的提取与鉴定,实验目的： 1、掌握组织中的核酸的提取与鉴定 2、掌握离心机的使用
9、 3、熟悉加样器的使用,实验原理 1、提取原理： a: DNA和RNA大部分与Pro结合成核蛋白。 b: 核蛋白可被三氯醋酸沉淀下来。 c: 10%NaCl溶液从沉淀中提取核酸，生成核酸 的钠盐 d: 乙醇把核酸钠沉淀下来,核苷 （B-R） 磷酸（P）,2、鉴定原理,核酸核苷酸,嘌呤（A G）,嘧啶,核糖（C U）,脱氧核糖（C T）,a:磷酸+钼酸铵 磷钼酸 钼蓝 b:嘌呤+AgNO3 絮状嘌呤银 c:核糖 糠醛 绿色化合物 d: 脱氧核糖 -羟基-酮基戊醛 蓝色化合物,氨基萘酚磺酸,H+,3，5-二羟基甲苯,H+,二苯铵,操作步骤,1、提取步骤 制备肝组织匀浆： 脱臼处死或断头处死 剖腹取
10、全部肝组织 生理盐水冲洗血污，吸干净 三氯醋酸2ml 分散匀浆机匀浆,分离提取 于全部匀浆内加入生理盐水2ml，玻棒混匀 静置3min， 3000rpm 3min, 弃上清 沉淀加入10%NaCl 2ml，沸水浴3min,玻棒搅拌 取出冷却，3000rpm 3min 取上清，逐滴95%酒精2管，混匀 静置5min，3000rpm 5min 弃上清，得白色核酸钠,核酸的水解： 短试管内加入5%H2SO4 3.5ml 玻棒搅匀 沸水浴中10min,成分的鉴定,沸水浴35min，观察结果，静置15min,观察结果,嘌呤的鉴定,磷酸的鉴定,放置3min，沸水浴35min，观察颜色差异,核糖的鉴定,沸水
11、浴510min，观察颜色差异,脱氧核糖的鉴定,沸水浴510min，观察颜色差异,注意事项,1、做鉴定部分时尽量用大试管，所有标 号朝试管上方 2、玻璃棒搅拌要轻柔 3、胶头滴管使用要注意顺序，避免污染,移液枪的使用 1、看清最大刻度，选择适当容量的移液枪（最大刻度和读数的关系） 2、先调好刻度 3、打至第一档吸入试剂 4、打出试剂时要按至第二档 5、使用加样器时要慢、稳，不要有气泡出 现,离心机的使用 台秤平衡 对称插入 定时定速,实验四 蛋白质呈色反应、沉淀反应及等电点的测定,实验目的： 1、掌握双缩脲法、茚三酮法、Folin法定性检查蛋白质的方法 2、验证几种蛋白质沉淀反应的现象及酸碱性环
12、境的影响 3、了解蛋白质等电点测定,一、蛋白质的呈色反应,实验原理： 双缩脲反应：含有CONH 、 CSNH、CH2NH等基团的化合物在浓碱液中与硫酸铜生成紫红色复合物。 茚三酮反应：含有自由氨基的化合物与茚三酮共热，生成紫色化合物。 Folin法： 酚性羟基在碱性环境中，与酚试剂生成钼蓝,操作步骤,（1）,+ 1：10鸡蛋白2滴 1%CuSO4 1滴,+ 10%NaOH 5 滴 混匀，观察颜色,（2）,+ 1：10鸡蛋白4滴 + 蒸馏水10滴 +0.1%茚三酮乙醇8滴，混匀，观察颜色,蒸馏水6滴+ 10%NaOH3 滴， 酚试剂1滴，混匀，观察颜色,+ 1：10鸡蛋白2滴,+ 0.25%白明
13、胶 0.25%酚溶液 0.25%酪氨酸,二、蛋白质的沉淀反应,实验原理： 1、盐析：破坏水化膜，中和电荷 常用中性盐：（NH4）2SO4、Na2SO4、NaCl,2、重金属盐类沉淀： 条件：PH PI，蛋白质带 负电荷 重金属离子：Cu2+、Hg2+、Pb2+、Ag+,3、生物碱试剂沉淀： 条件： PH PI，蛋白质带 正电荷 生物碱试剂：钨酸、苦味酸、鞣酸,操作见讲义,三 蛋白质等电点的测定,在某一PH下，蛋白质带正电荷和负电荷数相等，容易彼此结合形成沉淀，此PH值称为等电点。 操作见讲义,注意事项,1、酪氨酸和酪蛋白，酚溶液和酚试剂勿混淆 2、等电点测定时用大试管 3、先做第二个盐析实验,
