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1、新概念疫苗与基因免疫,智汇文库,免疫机制,特异性免疫,非特异性免疫 (固有免疫: 皮肤等屏障、吞噬细胞、补体、溶菌酶等),自然的,人工的,自然主动免疫,自然被动免疫,人工主动免疫,人工被动免疫,疫 苗,一、 传统疫苗的研究及应用,疫苗凡具有免疫原性、接种于机体可产生特异的自动免疫力，可抵御感染病的发生或流行，统称为疫苗。,第1节 疫苗新概念及新概念疫苗,细菌制备的制剂称为“菌苗” ； 把病毒及立克氏体等制备的制剂称为“疫苗” ； 以细菌代谢产物毒素制备的制剂称为“类毒素”。,能诱发自动免疫的制剂统称为“疫苗”,减毒活疫苗是指通过各种手段降低病原体的毒力，并以降低毒力后的病原体做疫苗，如脊髓灰质
2、炎疫苗(糖丸)及BCG等；,复制型重组疫苗又称载体疫苗(vector vaccine)，是将保护型的靶抗原编码基因通过细胞内重组或体外DNA操作等方式插入无毒、弱毒活或减毒的病毒(痘苗病毒、腺病毒等)或细菌(伤寒杆菌疫苗株、BCG等)中；,灭活疫苗是毒性病原体经灭活后使其丧失感染性，但仍保留免疫原性的疫苗。这类疫苗株不能在体内复制或繁殖。比如最近开发的H1N1甲流灭活疫苗，猪链球菌畜用灭活疫苗等；,纯化蛋白亚单位疫苗是分离、纯化病原体中一种或几种蛋白为靶抗原(有保护保用的抗原)，诱导机体产生中和性抗体,如HBV疫苗；,重组亚单位疫苗是用重组DNA技术，将编码靶抗原的基因插入表达载体中，在大肠杆
3、菌、酵母菌、哺乳动物细胞或昆虫细胞中表达这些抗原，经纯化后获得的亚单位蛋白结构；,合成肽疫苗是用固相合成法合成可诱生特异性免疫反应的多肽片段(抗原表位), 用作疫苗的靶抗原成分；,抗独特型疫苗(anti-idiotype vaccine)根据抗原和抗独特型均能与独特型(抗体)结合，因此认为抗独特型含有与抗原相似的氨基酸序列或空间构型(即内在影像)，所以抗独特型可以代替抗原作为疫苗。尤其是在抗原获得比较困难时，这种抗独特型疫苗就很有价值。,疫苗的 “活”或“死”决定了其诱生免疫应答的类型,死疫苗不能有效地进行MHC-I类抗原加工呈递,故死疫苗一般不会诱导有效的CMI；,活疫苗可有效地进行MHC-
4、I类抗原呈递，诱生细胞免疫。 但其常受到个体条件的限制； 活疫苗中常含有潜在致病性的生物活性成分； 活疫苗的贮存和运输的成本都较为昂贵。,二、疫苗新概念,疫苗(vaccine)最初是指接种牛痘苗预防天花的痘苗，其名来源于拉丁语中的雌牛(vacca)。,三、新概念疫苗,核酸疫苗,T细胞疫苗,树突状细胞疫苗,疫苗的三次革命,Pasteur在100年以前所开创的以炭疽和狂犬病疫苗为代表的第一次疫苗革命在技术上是细胞水平的研究和开发；,从20世纪70年代的中期开始，形成了以基因工程制备的乙型肝炎表面抗原为代表的分子水平的第二次疫苗革命；,上一世纪90年代初开始兴起的DNA疫苗被称为第三次疫苗革命。,(
5、一)核酸疫苗,核酸疫苗(nucleic acid vaccine)又称核酸免疫或基因免疫,是将含有编码特定外源抗原蛋白质的基因序列克隆到合适的质粒载体上，制备成核酸表达载体。通过肌肉注射等方法将其导入机体内，通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白质，表达产物与MHC结合而被递呈，从而激发机体免疫系统产生针对外源蛋白质的特异性免疫应答反应，即刺激机体产生相应的抗体和细胞毒性T淋巴细胞，分别介导体液免疫应答和细胞免疫应答。,(二)T细胞疫苗,T细胞疫苗原是指将T细胞或体外T细胞表位多肽刺激产生的T细胞作为疫苗接种，用于治疗某些自身免疫病。,近年来，将依据MHCI类分子特异的多肽结合基序(MHC bin
6、ding motif)合成的多肽，在体外诱导产生抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，用于治疗病毒性疾病。,1、治疗某些自身免疫疾病,自身反应性T细胞自身免疫疾病,灭活自身反应性T细胞接种机体,自身反应性T细胞自身免疫疾病,小鼠变态反应性脑脊髓炎；人类多发性硬化症,2、治疗某些病毒性疾病,病毒感染的清除：抗体 + CTL,过继免疫治疗如LAK细胞、CD3-AK细胞(CD3 McAb activated killer cells)均为非特异杀伤细胞，靶向性差；,直接接种单个或多个含CTL表位的多肽(多肽疫苗)，虽然可诱导机体产生特异性CTL应答，但常常滴度不高。,较短的TL多肽表位易被血清蛋白
7、酶所降解,CTL多肽疫苗,CTL应答弱,较短的TL多肽更易被血清蛋白酶所降解,将几个多肽交联？,加大抗原肽的量？,T细胞疫苗是用多肽在体外诱生产生特异性CTL，后者被克隆、扩增、筛选和鉴定后，仅将MHCI类限制的CD8+T 细胞输入机体，诱导细胞免疫应答。,(三)树突状细胞疫苗,DC是专职抗原递呈细胞，能有效地将抗原递呈给T淋巴细胞，从而诱导CTL活化。荷载抗原的DC具有疫苗功能，故称树突状细胞疫苗。,荷载抗原：病毒抗原、HLA限制的CTL表位基因，也可以是肿瘤细胞，还可以是编码肿瘤抗原的基因。,用抗原或抗原多肽体外冲击致敏DC，然后将之回输或免疫接种荷瘤宿主或带病毒特异性抗原的宿主，进行免疫
8、治疗；,利用DC与肿瘤细胞融合成为新型带有DC功能及肿瘤特异抗原的融合细胞瘤苗；,利用病毒载体等将带有肿瘤或病毒特异抗原的编码基因转染DC，使之DC细胞内持续表达相应特异抗原，诱导产生特异性抗肿瘤或抗病毒免疫反应。,常用的研究方法：,四、未来疫苗学的发展方向及展望,(一)针对感染性疾病的新疫苗,1、核酸疫苗的发展：,如何提高其在人体诱生特异性免疫应答的效率？,2、治疗性疫苗的发展 ：,能限制或根除已经呈现并确立的感染源或疾病。,部分依赖于DNA(即基因疫苗或核酸疫苗)。,(二)针对非感染性疾病的新疫苗,1、癌症：,特异性肿瘤抗原免疫反应，特异性地削减肿瘤细胞：黑色素瘤gp100基因和结肠直肠癌
9、CEA-B7.1基因等。,2、自身免疫性疾病：,类风湿性关节炎、多发性硬化症、重症肌无力、食物过敏、I型糖尿病、阿兹海默病以及对古柯碱和尼古丁上瘾的疫苗。,(三)新的疫苗传递技术,1、透皮性免疫预防；,2、转基因可食性植物递送疫苗；,3、可控性递送储存系统。,疫苗抗原包裹于由生物降解性聚合物如多糖多乳酸组成的微球体中，可定位于免疫系统中的多种细胞或可在注射位置形成储存场所，允许抗原随时间缓慢释放。,一、概述,五、基因免疫中目的基因的来源,六、基因免疫的注射途径和方法,二、基因免疫可能的分子机制,九、常用研究方法举例,第2节 基因免疫,三、基因免疫的载体结构,七、免疫保护效果评价,八、核酸疫苗安
10、全性评价,四、CpG的免疫佐剂效应在基因免疫中的作用,一、概述,1、什么是基因免疫？,基因免疫(gene immunization)又称DNA免疫(DNA immunization)、核酸疫苗(polynucleotide vaccine)、DNA疫苗、体细胞转基因免疫(somatic transgene immunization)、遗传免疫(genetic immunization)。,指将靶抗原编码基因置于真核表达调控元件的调控下，将该重组质粒DNA直接进行动物体内接种，并以与自然感染类似的方式呈递抗原，诱生特异性体液和细胞免疫应答的新理论和技术。,又称为裸DNA免疫(naked DNA
11、immunization)。,DNA Vaccines,The Third Vaccine Revolution,Plasmid vaccine,Plasmid yield antigenic protein,antigenic peptides,Memory T cell,Activated cytotoxic T cell,Memory B cell,Antibodies,cellular immunity humoral immunity,基因免疫不仅已广泛地应用于抗病毒、细菌、真菌、寄生虫等抗感染免疫中，同时也发现在肿瘤免疫及自身免疫性疾病中起重要作用；,常规基因免疫:将靶抗原编码基因
12、置于常规的病毒启动子(可以在真核细胞内启动表达)、增强子等调控元件的调控下，经肌肉接种免疫；,目前具有特异性靶向性、高表达水平、表达可调节性和选择性诱导某一特定类型免疫应答的新一代基因免疫。,2、基因免疫系统的建立,20世纪90年代初期建立，,质粒DNA可在体内肌细胞中以环状、非整合、非复制状态存在达1个月之久，而转基因产物的活性在体内可检测到达2个月之久。,美国的Wolff及Vical于1989年偶然发现:,1992年，Tang等，,首次证实编码抗原基因的质粒DNA注入小鼠体内不仅可表达相应的转基因产物，同时还可诱生基因产物特异的抗体应答。,将CMV启动子表达的人生长激素(hGH)基因以基因
13、枪注射的方式注入小鼠耳皮内，36周在小鼠体内可测到高水平的抗hGH特异性抗体应答。,这一研究成为开创基因免疫的先驱工作,基因免疫成了抗感染免疫等领域的新的研究热点。,基因免疫免去了繁琐的蛋白纯化步骤和免疫佐剂的辅助；,基因在体内的表达及诱生免疫的过程，模拟了自然状态下机体感染外源病原生物后，其在体内表达抗原及诱生免疫的过程。,基因疫苗可在体内合成与自然感染状态下表达的蛋白具有相同的构象和翻译加工方式的蛋白抗原；,内源合成的蛋白可有效地被MHC-I类分子呈递，模拟病原体繁殖后在体内表达抗原，诱生CTL的过程；,转基因在体内细胞表达的产物可在细胞裂解或凋亡时被释放至细胞外，或与凋亡细胞一同为APC
14、摄取，被MHC II分子呈递。,3、基因免疫的优势,重组质粒DNA在宿主体内存在时间长，产生持久免疫，能刺激黏膜免疫，诱导免疫记忆；,基因免疫采用的质粒DNA没有毒力回复的危险，较活疫苗更为安全；,同一个质粒可通过患联或并联的方式克隆多个目的基因，可实现一种疫苗预防多种疾病的目的；,DNA的制备、贮存极为方便和廉价，也更易进行基因水平上的操作和改造，从而更有利于制备多抗原基因疫苗；,基因免疫可能在一些特殊领域里有常规疫苗所不具备的应用价值，如新生儿免疫。,4、基因免疫的应用前景,由于基因免疫操作上简便、易行以及诱导免疫应答的相对高效性 基因免疫已在抗感染免疫及非感染性疾病如肿瘤、自身免疫性疾病
15、中广泛应用。,二、基因免疫可能的分子机制,基因被注入肌肉组织或皮下后，是如何被细胞摄取?,在细胞内表达的蛋白是如何递呈的?,微量抗原pg(10-12g)至ng(10-9g)，怎样诱导出宿主的免疫应答?,(一)质粒DNA直接转染体细胞,肌细胞结构特点:,多核细胞、肌织网；,T小管系统细胞外液并能伸到细胞内部，伸入到细胞内部的肌膜为浆膜小体(caveolae) 。,在电镜下是肌膜凹陷形成的小泡状结构 外源基因的内化是由浆膜小体介导的胞饮过程,DNA被摄入肌细胞过程：,DNA受体蛋白经由糖基磷脂酰肌醇(GPI)固定在浆膜小体表面并聚集成丛；,DNA与受体结合后，浆膜小体在开口处闭合并脱离肌膜；,DNA与受体在浆膜小体内分离，沿浓度梯度经浆膜小体到达胞浆(通过XX载体？)。,(二) 基因免疫中抗原呈递的分子机制,专职APC:巨噬细胞、树突状细胞、B细胞。,1、MHC II类应答的机制：,质粒DNA在转染的靶细胞中表达的蛋白抗原通过细胞分泌或细胞裂解的途径释放，为APC所摄取，并与MHCII类分子在晚期内体内结合，被呈递于APC表面。,激活Th细胞,Th1：IL-2/IFN-r，参与CMI,Th2：IL-4/IL-10，辅助HI,MHC II类应答,Ingestion,Secretion,Lysed release,输入淋巴管,生发中心,Th,Th,APC,Th,B,Th2,
