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1、第十三章 免疫细胞分离及检测技术Separation and Assays for Immunocyte,目的要求,掌握免疫细胞分离与纯化的方法;淋巴细胞、吞噬细胞的功能检测的方法。熟悉淋巴细胞数量检测的方法与原理。,教学内容,1. 免疫细胞的分离与纯化,2. 淋巴细胞的数量检测,3. 淋巴细胞的功能检测,4. 吞噬细胞的功能检测,第一节 免疫细胞的分离与纯化Separation and Purification of Immunocyte,实验的目的；,所需细胞的种类、纯度和数量；,方法简便可行，尽量保持活性、 纯度和收获率。,一、白细胞的分离,（一）自然沉降法,利用血细胞自然沉降率的分离方
2、法。,（二）聚合物加速沉降法,某些高分子聚合物（如明胶、右旋糖酐、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮等）可使红细胞凝聚成串，加速红细胞沉降，使之更易与白细胞分离。,(二）聚合物加速沉降法,某些高分子聚合物（如明胶、右旋糖酐、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮等）可使红细胞凝聚成串，加速红细胞沉降，使之更易与白细胞分离。,二、外周血单个核细胞分离,外周血单个核细胞 （peripheral blood mononuclear cell),主要指淋巴细胞和单核细胞，是免疫学实验中最常用的细胞群。密度为1.0751.090 。,分离液的基本要求,对细胞无毒,基本等渗,不溶于血浆或分离物质,有一定密度,密度梯度离心法
3、（density gradient centrifudation),Ficoll（商品名） 成份：2份6%聚蔗糖（ficoll)水溶液 + 1份34%泛影葡胺（hypaque)生理盐水溶液。 最常用的方法，分离纯度可达95%，细胞获取率80% 。试验尽量在低温下进行（4 8 或冰浴）。,密度梯度分离单个核细胞（Ficoll分层液）,密度梯度分离单个核细胞（Ficoll分层液）,Percoll (商品名） 经过聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrolidone,PVP)处理的硅胶颗粒大小不一的混悬液。 高速离心后，形成连续密度梯度，可将密度不同的细胞分离纯化。分离淋巴细胞纯度达98% ，单
4、个核细胞纯度达78% 。流程长、烦琐、费用高。,密度梯度分离单个核细胞（ Percoll分层液）,三、淋巴细胞的分离与纯化,（一）红细胞的去除 无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。,（二）血小板的去除 离心洗涤23次。,PBMC悬液富含淋巴细胞，但有混杂有单核细胞、红细胞和血小板。,(三） 单核细胞和粒细胞的去除,黏附法 利用二者具黏附玻璃、塑料和葡聚糖凝胶（Sephhadex G-10)等特性。95%为淋巴细胞，活性大于95% 。但损失部分B淋巴细胞。,2.磁铁吸引法 PBMC吞噬直径3um的羰基铁颗粒，用磁铁将细胞吸至管底，上清即含较纯的淋巴细胞。,3. Percoll分层液法,
5、密度梯度分离单个核细胞（ Percoll分层液）,四、T细胞和B细胞的分离,(一）E花环沉降法 成熟T细胞表面有SRBC受体（E受体），可和SRBC形成E花环，B细胞则无。但可活化T细胞。,E花环(电子显微镜）,（二）EA花环,B细胞表面带有IgG Fc段受体，AgAb复合物中IgG Fc段牢固结合；这类红细胞抗体致敏的动物红细胞（EA)黏附在B细胞周围形成花环。,（三）尼龙毛柱分离法,利用B细胞和单核细胞具有黏附在尼龙（nylon wool) 表面的特性。 先洗脱出的事T细胞，再用培养也便冲洗边捻压塑料管，流出来的液体中主要含B细胞。T细胞纯度达90%，B细胞纯度达80% 。,四、细胞亚群的
6、分离,（三）荧光激活细胞分离仪分离法 (fluorescence activated cell sorter, FACS),（一）亲和板结合分离法 （二）磁性微球分离法,亲和板分离淋巴细胞示意图,磁性微球分离淋巴细胞示意图,五、细胞的保存及活力测定,保存 10%20%的灭活小牛血清等渗培养液重悬。 短期置4，长期：二甲亚砜+ -196 活力测定 台盼兰染色死细胞呈蓝色，活细胞不着色。,第二节 淋巴细胞表面标志的检测 及亚群分类 Assays for Lymphocyte Surface Marker and Subpopulations,不同淋巴细胞表面有特定的标志，可用于对不同淋巴细胞的鉴定
7、和计数。 常用方法 间接荧光免疫法、酶免疫组组化学法、微量细胞毒试验、花环技术等。,一、淋巴细胞表面标志,二、T淋巴细胞表面标志的检测 三、B淋巴细胞表面标志的检测 四、NK细胞表面标志的检测 NK(nature killer cell) CD3-、CD16+、CD56+,第三节 淋巴细胞功能检测技术 Assays for Lymphocyte Function,一、T细胞功能检测,（一）T细胞增殖试验 T细胞在体外受有丝分裂原或抗原刺激后，细胞代谢和形态发生变化，主要表现为胞内蛋白质和核酸合成增加，发生一系列增殖反应。如细胞变大、胞质增多、出现空泡、核质疏松、核仁明显并转化为淋巴母细胞，又称
8、淋巴细胞转化试验（lymphocyte transformation test ,LTT),体外刺激物,特异性刺激物：PPD、肿瘤抗原、 同种异体细胞等。 非特异性刺激物： PHA、ConA、PWM 。,最常用PHA，T细胞对特异性和非特异性抗原识别过程不一，但分裂和增值过程相同。,转化的淋巴细胞 200淋巴细胞,转化率=,（一）形态法,正常值：60%80% 小于50%可视为降低,X100%,成熟淋巴细胞,转化淋巴细胞,转化淋巴细胞,（二）3H-TdR掺入法,SI = 刺激管cmp/对照管cmp SI ( stimulation index ) 刺激指数 cmp （每分钟脉冲数） 正常值 SI
9、2,(三）MTT比色法,SI =,试验管OD均值,对照管OD均值,二、B细胞功能检测,（一） B细胞增殖试验 刺激物 EBV、抗IgM、 LPS 、 PPD、PWM、IL-2、IL-4。 （二）溶血空斑试验 （三）酶联免疫斑点试验 （四）体内试验,三、NK细胞功能检测,人 K526细胞株 小鼠 YAC-1细胞株,第十四章 吞噬细胞功能检测 Assays for Phagocyte Function,第一节 中性粒细胞功能的检测Assays for Polymorphonuclear Function,一、细胞运动功能的检测,（一）体内实验法 （二）体外试验法 二、吞噬和杀菌功能的检测 （一）细
10、胞内杀菌功能的检测,吞噬率 =,吞噬指数 =,吞噬细菌的白细胞数,计数的白细胞数,X 100%,吞噬细菌总数,计数的白细胞数,胞内含着色菌体的细胞数,杀菌率 =,计数的白细胞,X 100%,正常值,吞噬率 61%64% 吞噬指数 接近1 大肠埃希菌 90% ， 金黄色葡萄球菌 85%,第二节 巨噬细胞功能的检测 Assays for Cell of the Mononuclear Phagocyte system Function,一、吞噬功能的检测,吞噬物 CRBC、酵母菌 吞噬率 吞噬指数 观察消化程度 I级 未消化 II级 轻度消化 III级 完全消化,二、炭粒廓清试验,三、巨噬细胞溶酶体酶的测定 四、巨噬细胞促凝血酶活性测定,
