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1、,第七章 免疫电泳技术,,（counter immunoelectrophoresis,CIEP）,原理是将双向免疫扩散与电泳相结合的定向加速的免疫扩散技术，其在pH8.4以上的缓冲液中，大部分蛋白质抗原成分带负电，在电场中向正极移动；而作为抗体的IgG因其分子量大，暴露的极性基因较少，解离也少，在电场中亦向正极缓慢移动，但电渗引向负极移动的液流速度超过了lgG向正极的移动，带动抗体移向负极,在抗原抗体最适比处形成乳白色沉淀线，这就是电渗所致的IgG呈反向负极倒退。,对流免疫电泳,,,火箭免疫电泳（rocket immunoelectrophoresis，RIE）技术是将单向免疫扩散与电泳相结
2、合的一项检测技术。,火箭免疫电泳,,火箭电泳操作时应注意以下几点： .所用琼脂要选择无电渗或电渗很小的，否则火箭形状不规则。 .注意电泳终点时间，如火箭电泳顶部呈不清晰的云雾状或圆形皆提示未达终点。 .标本数量多时，电泳板应先置电泳槽上，搭桥并开启电源（电流要小）后再加样。否则易形成宽底峰形，使定量不准。,,.作IgG定量时，由于抗原和抗体的性质相同，火箭峰因电渗呈纺锤状。为了纠正这种现象，可用甲醛与IgG上的氨基结合（甲酸化），使本来带两性电荷的IgG变为只带负电荷，加快了电泳速度，抵消了电渗作用，而出现伸向阳极的火箭峰。,,免疫电泳（immunoelectrophoresis，IEP）技术
3、，是区带电泳与免疫双扩散相结合的一种免疫化学分析技术。检测原理是将待测样品置于琼脂糖凝胶上进行电泳，样品中各蛋白质成分因分子量及电泳迁移率不同，被分离成肉眼不可见的若干区带。停止电泳后，沿与电泳方向平行的两侧开槽并加入抗血清。置室温或37使两者扩散，经1824小时后，各区带蛋白在相应位置与抗体反应形成弧形沉淀线。抗原含量越多，则反应沉淀线越接近抗体槽，形成的沉淀弧线较粗，反之，则形成的沉淀线较细。,免疫电泳,,以此可作细微的蛋白质组分分析。根据各蛋白所处的电泳位置，将沉淀弧的位置、形态与已知标准抗原、抗体生成的沉淀弧进行比较，可分析待测样品中所含成分的种类及性质、例如，多发性骨髓瘤患者血清在免
4、疫电泳后，可观察到异常的M蛋白沉淀弧，而其他类型的免疫球蛋白形成的沉淀弧可明显细、短于对照沉淀弧（图74）。,,,免疫固定电泳（immunofixation electrophoresis，IFE）是区带电泳与免疫沉淀反应相结合的技术。Alfonso在1964年第一个报道了免疫固定技术（IFE），1969年Alper与Johson相继报道了IFE在铜蓝蛋白、lgG基因的多态性检测和C3激活后分子转变中的应用,免疫固定电泳,,第九章 荧光免疫技术 荧光免疫技术（fluoroimmnoassay）是将免疫学反应的特异性与荧光技术的敏感性结合起来的一种方法，是免疫标记技术中发展最早的一种检测方法。,
5、,（一）荧光色素 许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用做荧光色素。只有那些能产生明显荧光的有机化合物才能作为荧光色素。,荧光物质,,常用的荧光色素有： .异硫氰酸荧光素（fluoresceln isothiocyanate，FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490495nm，最大发射光波长520530nm，可呈现明亮的黄绿色荧光。有两种同分异构体，其中异构体型在效率、稳定性、与蛋白质的结合力等方面都更加良好，在冷暗干燥处可保存多年。FITC是应用最广泛的荧光素。其主要优点在于：人眼对黄绿色较为敏感，通常标本中的绿色荧光较少，有利于降低
6、背景干扰。,,.四乙基罗丹明（rhodanune，RB200）为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595600nm，呈橘红色荧光。可与FITC的翠绿色荧光形成鲜明的对比，常用于双重标记或对比染色。但荧光效率较低。,,.四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamine isothiocyanate，TRITC）其最大吸收光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。荧光效率亦较低，但因其荧光猝灭速度慢，除作衬染外，也可单独采用。,,.藻红蛋白（R-RE）是红藻和绿藻中一类被称为藻蛋白（phyco
7、blliprotein）家族中的一员，与光合作用有关。其分子量为240000。其最强吸收光波长为565nm，最大发射光波长为578nm。它在488nm处的光吸收率为565nm处（最大的）的75。因此R-RE可以有效地与FITC一起用于双色免疫荧光染色，因为它们可以共用488nm激发光。,,（一）荧光显微镜 荧光显微镜是荧光显微技术的基本工具。其主要结构与普通光学显微镜基本相同，与普通显微镜不同之处在于光源、滤板以及不吸收紫外线的聚光器和镜头等。 .光源,荧光免疫分析常用的仪器和设备,,.滤板 滤板的作用在于隔热、选择适宜的激发光及选择适宜的检测光。按其作用分为隔热滤板、激发滤板及吸收滤板。 （
8、1）隔热滤板：能阻断红外线的透过而隔热。它安装在灯室聚光镜的前面。,,（2）激光滤板：能选择性地透过紫外线可见波长的光域，以激发荧光色素。激发滤光片有两种，UG为紫外光滤片，只允许波长275400nm的紫外光通过，最大透光度在365nm。BG为蓝紫外光滤片，只允许波长325500nm的蓝紫外光通过，最大透光度为410nm。,,（3）吸收滤板：位置是靠近目镜的一组阻挡滤光片又称吸收滤光片或抑制滤光片，其作用是阻断激发光而使发射的荧光透过，使标本在暗的背景上呈现荧光易于观察，也使眼睛免受强激发光刺激。吸收滤光片的透光范围为410650nm，代号有OG（橙黄色）和GG（淡绿黄色）两种。,,.光路 （
9、1）透射光：其照明光线从标本下方经过聚光器会聚后透过标本进入物镜。它适于观察对光可通透的标本。 （2）落射光 （二）荧光分光光度计,,第二节 荧光抗体的制备 荧光抗体是免疫荧光技术的关键试剂，荧光抗体是将荧光素（如 FITC）与特异性抗体以化学共价键的方式结合而成的。,,一、抗体与荧光素的结合 用于标记的抗体应该具有高特异性及高亲和力。所用抗血清中不应含有针对标本中正常组织的抗体，一般需经纯化，提取IgG作标记。用于标记的荧光素应符合以下要求： 应具有能与蛋白质分子形成共价键的化学基团，结合后不易解离，而未结合者易于清除； 荧光效率高，与蛋白质结合后；仍能保持较高的荧光效率；,,荧光色泽与背景
10、组织的色泽对比鲜明； 与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫学性质，与蛋白质的结合物稳定，易于保存； 标记方法简单、安全无毒。常用的标记蛋白质与荧光素的结合方法有搅拌法和透析法两种。,,（一）搅拌法 （二）透析法 二、标记抗体的纯化 （一）透析法 将标记的抗体放入透析袋中，不断更换透析液透析1周左右，至透析液在紫外灯下照射不发荧光为止，本法适用于蛋白含量低的标记物处理。 （二）凝胶过滤法 将标记的抗体过凝胶柱，常用的凝胶为 Sephadex G50，洗脱第一峰为结合蛋白峰，第二峰为荧光素峰，收集第一峰。本法简便快速，可在数小时内完成。,,三、去除过度标记的蛋白 结合的荧光抗体，并不是均一的
11、，有的过量结合，有的未结合。过量结合者是非特异荧光着色的来源之一，而未结合者有抑制特异性荧光抗体反应的作用，两者皆应去除。 四、去除非特异反应抗体 五、荧光抗体活性鉴定,,第三节 免疫荧光显微技术 一、标本的制作 荧光显微技术主要靠观察切片标本上荧光抗体的染色结果来对抗原进行鉴定和定位。因此标本制作的好坏直接影响到检测的结果。,,二、荧光抗体染色 （一）直接法 用特异荧光抗体直接滴加于标本上，使之与抗原发生特异性结合 （二）间接法 本法用两种抗体相继作用，第一抗体为针对抗原的特异抗体；第二抗体为荧光标记的抗体，是针对第一抗体的抗抗体，其实质是探测第一抗体是否结合于组织抗原上的标记探针,,,三、荧光显微镜检查 经荧光抗体染色的标本，需要在荧光显微镜下观察。最好在染色当天即作镜检，以防荧光消褪，影响结果。,,第四节 免疫荧光技术在医学检验中的应用 、荧光抗体技术在临床检验上已用作细菌、病毒和寄生虫的检验及自身免疫病的诊断等方面。 、荧光抗体染色法对脑膜炎双球菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、布氏杆菌和炭疽杆菌等的实验诊断有较好效果。 、免疫荧光间接染色法可用于测定血清中的抗体，用于流行病学调查和临床回顾诊断。,
