发酵工程的灭菌与空气除菌

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1、第五章 发酵工程的灭菌 和空气除菌,黄小龙 农学院生物技术系,本章内容,第一节 常用的灭菌方法 第二节 培养基与发酵设备的灭菌 第三节 空气的除菌,1) 生产菌和杂菌同时生长，生产菌丧失生产能力； 2) 在连续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比生产菌生长得更快，结果使发酵罐中以杂菌为主； 3) 杂菌及其产生的物质，使提取精制发生困难； 4) 杂菌会降解目的产物；杂菌会污染最终产品； 5) 发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现象。,在发酵过程中染菌严重的后果,第一节 常用的灭菌方法,一、定义 1、培养基灭菌的定义 从培养基中杀灭所有有生活能力的微生物营养体及其孢子，或从中将其除去。 工业规模

2、的液体培养基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌更为常用。,第一节 常用的灭菌方法,2、灭菌与消毒的区别 灭菌（sterilization）：用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。 消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿内外的病源微生物。,二、工业生产中的灭菌 1、工业上具体措施包括: （1）使用的培养基和设备须经灭菌； （2）好氧培养中使用的空气应经除菌处理； （3）设备应严密，发酵罐维持正压环境； （4）培养过程中加入的物料应经过灭菌； （5）使用无污染的纯粹种子。,二、工业生产中的灭菌 2、培养基灭菌的目的 杀灭培养基中的微生物，为后续发酵过程创造无菌的条件。

3、 3、培养基灭菌的要求 （1）达到要求的无菌程度(10-3)。 （2）尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中，培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的： 培养基中不同营养成分间的相互作用； 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。,4、灭菌的方法 （1）化学法（化学药品灭菌法）： 化学药品直接作用于微生物而将其杀死的方法。消毒剂与防腐剂的区分并不严格。 灭菌机理： 化学物质（高锰酸钾、漂白粉等）与微生物细胞中的某些成分产生化学反应，如蛋白质变性、核酸的破坏、酶的失活、细胞膜透性的改变而杀死微生物。,常用的化学药剂： 石碳酸、甲醛、氯化汞、碘酒、酒精等。主要用于生产车间环境、无菌室空间、接

4、种操作前小型器具及双手的消毒等以及染菌后的培养基。 根据灭菌对象的不同使用方法有浸泡、添加、擦拭、喷洒、气态熏蒸等。,9,（2）物理法 射线灭菌法： 利用紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的射线进行灭菌的方法。波长范围在200275nm的紫外线具有杀菌作用，杀菌作用最强的范围是250 270nm，波长为253.7nm的紫外线杀菌作用最强。 在紫外灯下直接暴露，一般繁殖型微生物约3 5min，芽孢约10min即可杀灭。,紫外线灭菌机理： 在紫外线照射下微生物细胞的DNA遭到破坏，形成胸腺嘧啶二聚体和胞嘧啶水合物，抑制DNA的复制。此外，空气在紫外线照射下生成的臭氧也有一定的杀菌作用。,11,紫外

5、线穿透力较差，一般只适于接种室、超净工作台、无菌培养室及物质表面杀菌。不同微生物对紫外线的抵抗力不同，对杆菌杀灭力强，对球菌次之，对酵母菌、霉菌等较弱，因此常与化学灭菌结合使用。,（2）物理法 干热灭菌法 ： 灭菌机理：在干燥高温条件下，微生物细胞内的各种与温度有关的氧化还原反应速度迅速增加，致死微生物。 灼烧灭菌法；玻璃器皿、金属器材和其他耐高温的物品在干热灭菌器中，于160下保存1h。有纸或棉塞者灭菌不能超过170。,（2）物理法 过滤除菌： 使用适当的过滤材料或介质对液体或气体进行过滤，除去微生物的方法。 主要适用于：热敏感物质（生长因子、抗生素、培养基）的灭菌和发酵用无菌空气的制备。,

6、湿热灭菌法： 利用饱和蒸汽进行灭菌。释放大量热量和强大穿透力使生物大分子化学键受到破坏。常用于培养基、发酵设备、附属设备、管道和实验器材的灭菌。 煮沸灭菌法：将物品在水中煮沸15-20min，一般微生物细胞可杀死，但不能杀死孢子。适用于食品、器具消毒。无芽孢菌用60 10min，芽孢用100 10min以上，嗜热细菌用120 20-30min可完全杀死。,间歇灭菌法： 反复几次的常压蒸汽灭菌，已达到杀死微生物营养体和芽孢的目的。100 30-60min而杀死微生物营养体，置37 培养1h，使其芽孢发育成营养体，次日再同样的方法处理，反复3次。适用于不能高压灭菌的物质，如糖类、明胶、牛奶培养基等

7、。 高压蒸汽灭菌： 使用密闭的高压蒸汽灭菌锅。实验室常用压力为0.1兆帕（MPa，一公斤的压力），121 15-30min，可杀死各种微生物及芽孢。常用于培养基、发酵设备、管道、实验器材等。,第二节 培养基与发酵设备的灭菌,一、影响培养基灭菌的因素 （1）培养基成分 培养液中油脂、糖类及一定浓度的蛋白质会增加微生物的耐热性。高浓度盐类、色素能削减其耐热性。,随着灭菌条件的强化, 培养基成分的热变质加速，特别是维生素。因此培养液灭菌一般都采用高温短时加热的方式，这样可以达到彻底灭菌和把营养分破坏减少到最低限度的目的。,一、影响培养基灭菌的因素,（2）培养基成分颗粒度 培养基成分的颗粒越大，蒸汽穿

8、透所需时间越长。小于1mm颗粒的培养基，可不必考虑颗粒对灭菌的影响，但对于含有少量大颗粒及粗纤维培养基的灭菌，特别是存在凝结成团的胶体时会影响灭菌效果，则应适当提高灭菌温度或过滤除去。,（3）培养基pH pH对微生物耐热性影响很大。微生物一般在pH6.08.0时最耐热；pH6.0，氢离子易渗入微生物细胞内，从而改变细胞的生理反应促使其死亡。pH越低，灭菌所需时间越短。,（4）微生物细胞含水量 含水量少，蛋白质不易变性，但在灭菌时，如果是含水量很高的物品，高温蒸汽的穿透效果也会降低，所以灭菌时间也要延长。,（5）微生物性质与数量 1) 各种微生物对热的抵抗力相差较大，细菌的营养体、酵母、霉菌的菌

9、丝体对热较为敏感，而放线菌、酵母、霉菌孢子对热的抵抗力较强； 2) 繁殖期的微生物对高温的抵抗力比衰老期微生物抵抗力 小得多； 3) 微生物数量越多，所需灭菌时间越长； 4) 天然原料配成的培养基含菌量高于纯粹用化学试剂配制成的组合培养基。,（6）冷空气排除情况 冷空气不但导热性差，阻碍蒸汽接触欲灭菌的物品，还会降低蒸汽分压，使罐内实际温度低于压力表所对应的温度，造成灭菌温度不够。 （7）泡沫 泡沫中的空气形成隔热层，使热量难以渗透进去，需加消泡剂。 （8）搅拌 避免局部过热或形成灭菌死角。,二、培养基的灭菌 无菌的标准： 根据微生物热死灭方程，要求灭菌后达到绝对无菌是很难做到的，也是不必要的

10、。因此在工程设计中常取N=10-3(N:培养基中残存的活菌数）。 工业化生产中培养基的灭菌采用湿热灭菌方式，主要有两种方法：分批灭菌和连续灭菌。,（一）分批灭菌（batch sterilization）,又称间歇灭菌，就是将配制好的培养基全部输入发酵罐内或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备加热至灭菌温度后维持一定时间，再冷却到接种温度，这一工艺过程称为实罐灭菌，是使培养基和发酵罐同时灭菌的一种方式。,优点：无需专一灭菌设备，操作简便。 缺点：加热和冷却时间较长，易发生过热破坏营养分 的现象，发酵罐利用率低。 灭菌流程：包括：加热、维持、冷却3阶段。,流程操作： 先预热一定时间，使物料溶胀均

11、匀受热，预热90以上时，将蒸汽直接通入培养基及罐中，可减少冷凝水生成量。温度达到120时计算维持时间。生产中常用维持时间30min。为了减少营养成分的破坏多采用快速冷却方式，立即向罐内通入无菌空气，以维持罐压,然后开启冷却系统进行冷却。,分批灭菌设备示意图,三路进汽：蒸汽从通风、 取样和出料口进入罐内 直接加热，直到所规定 的温度，并维持一定的 时间。这就是所谓的 “三路进气”。 四路出汽：在液面以上 的管道口则应排放空 气，即蒸汽从排气、接 种、进料和消沫剂管排 气。这样做可以达到不 留灭菌死角。,（二）连续灭菌(continuous sterilization),连续灭菌是将培养基通过专门

12、设计的灭菌器，进行连续流动灭菌后，进入预先灭过菌的发酵罐中的灭菌方式，也称之为连消。 连续灭菌设备主要由灭菌系统、冷却系统、烘干系统及电器系统组成。附属设备由进料输送带散布机，出料输送带等组成。 灭菌系统采用专一灭菌设备-连消塔(或器)。,优点： 高温快速灭菌工艺，营养成分破坏的少； 发酵罐的非生产占用时间短，容积利用率提高； 热能利用合理，适合实行自动化控制； 缺点： 不适用于粘度大或固形物含量高的培养基灭菌； 增加一套连续灭菌设备，增多了操作环节，增加染菌 的机率。,连消塔-喷淋冷却连续灭菌的基本流程,流程：在短时间内使物料在连消塔中的温度达到灭菌温度126132，然后进入维持罐中保温5

13、8min，然后物料以层流的方式保持先进先出、后进后出的状态流至维持罐出口完成灭菌时间，再进入冷却器快速换热冷却后进入灭菌完毕的发酵罐中。,喷射加热-真空冷却连续灭菌流程图,典型的蒸汽喷射式-真空冷却过程中培养基温度随时间的变化曲线,喷射器结构示意图,连续灭菌与分批灭菌的比较,1、连续灭菌的优缺点 优点 保留较多的营养质量； 容易放大； 较易自动控制； 糖受蒸汽的影响较少； 缩短灭菌周期； 在某些情况下，可使发酵罐的腐蚀减少； 发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均匀。 缺点 设备比较复杂，投资较大。,2、分批灭菌的优缺点 优点 设备投资较少； 染菌的危险性较小； 人工操作较方便； 对培养基中固体物质含量

14、较多时更为适宜； 缺点 灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大，一般只限于中小型发酵装置。,（三）固体培养基灭菌,固体培养基要先蒸煮灭菌,但固体培养基呈粒状、片状或粉状，流动性差，不易翻动，吸水加热易成团, 冷却困难。针对这些特点设计的转鼓式灭菌机常用于酒厂、酱油厂。,转鼓式灭菌器，可以0.51r/min转动，培养基能得到较为充分的混匀，轴的中心是一带孔的圆管，蒸汽沿轴中心通入鼓内培养基中进行加热，达到一定温度后，进行保温灭菌。灭菌结束后用真空泵对转鼓抽气，降低鼓内压力和培养基的温度。,三、管道与发酵罐等的灭菌,（1）种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐灭菌及管 道灭菌 从有关管道通入

15、蒸汽，使罐内蒸汽压力达0.147 MPa，维持45 min，灭菌过程从阀门、边阀排出空气，并使蒸汽通过到达死角灭菌。 （2）空气总过滤器和分过滤器灭菌 排出过滤器中的空气，从过滤器上部通入蒸汽，并从上、下排气口排气，维持压力0.174 MPa灭菌2 h。灭菌完毕，通入压缩空气吹干。 （3）补料实罐灭菌 根据料液不同而异，淀粉料液为121 ，维持5 min；尿素溶液灭菌 105 ，维持5 min。,第三节 空气的除菌,一、发酵使用的净化空气的标准 二、空气净化的方法 三、介质过滤除菌的原理 四、空气净化的工艺流程,一、发酵使用的净化空气的标准,（一）无菌空气的概念 发酵工业应用的“无菌空气”是指

16、通过除菌处理使空气中含菌量降低在一个极低的百分数，从而能控制发酵污染至极小机会。此种空气称为“无菌空气”。,一、发酵使用的净化空气的标准,（二）空气中微生物的分布 空气中的含菌量随环境不同而有很大差异： 一般干燥寒冷的北方空气中的含菌量较少， 而潮湿温暖的南方则含菌量较多； 人口稠密的城市比人口少的农村含菌量多； 地面又比高空的空气含菌量多。,各地空气中所悬浮的微生物种类及比例各不相同，数量也随条件的变化而异，一般设计时以含量为103104个m3进行计算。,（三）发酵对空气无菌程度的要求 各种不同的发酵过程，对空气无菌程度的要求也不同： 不同菌种的生产能力、生长速度、发酵周期、产物性质、培养基营养成分和pH的差异等不同，对空气质量有不同的要求； 如：氨基酸和抗生素因发酵周期长短的不同；对无菌空气 要求不同。,发酵工业的“无菌空气”；一般按染菌机率为10-3来计算，即1000次发酵周期所用的无菌空气只允许12次