《2012秋季期生化理论授课课件1氨基酸纸层析法》由会员分享，可在线阅读，更多相关《2012秋季期生化理论授课课件1氨基酸纸层析法（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、一、实验目的：,1.学习纸层析法的基本原理； 2.掌握纸层析法分离氨基酸的操作技术。,实验一、氨基酸的纸层析法,二、实验原理：,纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，它利用不同的氨基酸在展层溶剂中的分配系数不同而得以分离的一种方法。,惰性支持物是新华一号滤纸，其上含有很多的羟基，与水有较强的亲和力因此把它看成是含有静止水相的惰性支持物。水相因此称为静止相（固定相），有机溶剂称为流动相。 展层溶剂由两个互不相溶的有机溶剂和水组成，它们互相混合时便分成两相：一相是以水饱和了的有机相，另一相是以有机溶剂饱和了的水相。 分配系数()溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。 当用滤纸进行分配层析时
2、，流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使氨基酸在两相之间不断分配而得以分离。 物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移）来表示的： 如下图 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统；层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。,实验一、氨基酸的纸层析法,1. 层析缸 2. 毛细管 3. 喷雾器 4. 培养皿 5. 层析滤纸 6. 烘箱（用前指导）,实验一、氨基酸的纸层析法,三、实验仪器：,1. 扩展剂： 是4份水饱和的正丁醇和一份醋酸的混合物。将20ml正丁醇15ml水放入分液漏斗中混匀，充分振荡，静置后分层，放出下层水层
3、，再和5ml冰醋酸混合。取漏斗内的扩展剂约5ml置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。 2. 氨基酸溶液： 0.5的赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合物（各组分浓度均为0.5） 3. 显色剂: 0.1茚三酮-正丁醇溶液,四、实验试剂：,实验一、氨基酸的纸层析法,取层析滤纸一张，在纸的一端距边缘23cm处用铅笔划线， 每隔2cm做一个记号,用毛细管将各氨基酸样品分别点在这四个位置，干后再点一次,用別针缝成筒状，将盛有20ml扩展剂迅速置于密闭的层析缸 中并将滤纸直立于培养皿中，待溶剂上升1520cm时取出滤 纸，用铅笔描出溶剂前沿界限，自然干燥或用吹风机热风吹干,用喷雾器均匀喷上0
4、.1茚三酮正丁醇溶液, 置于烘箱中烘烤5min（100）或用热吹风吹干,描点、测量和计算各种氨基酸的Rf值,描点计算,滤纸定点,点样,展层,显色,实验一、氨基酸的纸层析法,五、操作方法：,在操作过程中应注意： 手和桌面保持干净，且手不要摸滤纸； 点样直径不超过3mm ； 将点有样品的滤纸缝成筒状，两边不能接触； 点样的一端朝下, 扩展剂的液面需低于点样线1cm； 即时取出滤纸, 以免出现氨基酸层析跑到滤纸的外面不能检测； 喷显色剂时要均匀且不要“流泪”； 及时描点； 量取距离要准确； 要根据实验室的现有设备和实际进行实验； 废液倒在废液桶中统一拿到废液池中处理。,合理安排时间：先讲前三步注意事项，待展层时再讲后面的注意事项,六、注意事项：,实验一、氨基酸的纸层析法,叙述实验原理和操作步骤（上交层析图谱，统一贴在报告纸上的左上角）。,七、实验报告：,实验一、氨基酸的纸层析法,
