酶工程幻灯片

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1、酶的发酵生产根据细胞培养方式的不同，可分为 固体培养发酵、 液体深层发酵、(应用最为广泛） 固定化细胞或固定化原生质体发酵,概论与流程：微生物酶发酵生产的分类,第三节 发酵工艺条件及控制,微生物发酵产酶方法 1.固体培养:特别适合于霉菌培养 2.液体培养:目前酶发酵生产的主要方式 3.固定化细胞 :需要特殊的固定化细胞反应器,分解代谢物阻遏,又称“葡萄糖效应”，指葡萄糖和其它容易利用的碳源，其分解代谢产物能阻遏某些酶（尤其是参与分解代谢的酶）合成的现象。分解代谢物阻遏产生的原因，一是葡萄糖等碳源分解氧化积累ATP，需消耗AMP，AMP浓度下降后胞内cAMP会水解生成AMP来补充。cAMP浓度降

2、低使cAMP-CAP复合物减少，酶基因启动子上就没足够cAMP-CAP复合物结合，RNA聚合酶也就无法结合到启动子上，导致转录无法进行，酶合成受到阻遏。 随着细胞生长使ATP消耗，AMP和cAMP浓度增加，cAMP-CAP结合到启动子上使RNA聚合酶也能结合上，酶合成阻遏解除。可见分解代谢物阻遏及其解除的实质，是cAMP通过启动子对酶基因表达进行调控。,二、产酶动力学 （一） 酶生物合成的模式 根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶的生物合成分为3种类型，4种模式，即： 同步合成型 生长偶联型 中期合成型 部分生长偶联型延续合成型 非生长偶联型 滞后合成型,1. 生长偶联型（又称同步合成型）

3、 酶的生物合成与细胞生长同步。 特点：酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。 当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止，表明这类酶所对应的mRNA很不稳定。,2.生长偶联型中特殊形式中期合成型 酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。 特点：酶的合成受分解代谢物阻遏或产物的反馈阻遏。 所对应的mRNA是不稳定的。,枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线,3.部分生长偶联型（又称延续合成型） 酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。 特点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。 所对应的mRNA

4、相当稳定。,黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线,4. 非生长偶联型（又称滞后合成型） 只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。 特点：受分解代谢物的阻遏作用。 所对应的mRNA稳定性高。,黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线,酶生产中最理想的合成模式： 延续合成型：发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。 对于： 同步合成型：提高对应的mRNA的稳定性，如降低发酵 温度 。 滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使 酶的合成提早开始。 中期合成型：要在提高mRNA稳定性以及解除阻

5、遏两方 面努力。,动物细胞培养,从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。,.,应用.,二、动物细胞培养的特点,（1）主要用于功能蛋白质和多肽的生产 （2）生长较慢，15-100h （3）需要添加抗生素以防染菌 （4）无细胞壁，体积较大，对剪切力敏感，要求严格控制培养条件如通风、搅拌、pH、渗透压等 （5）大部分动物细胞有锚地依赖性，需要贴壁培养 （6）培养基成分复杂，分离纯化复杂，成本较高，多用于高价值药物的生产 （7）原代细胞培养50代之后即会退化死亡，需要重新分离细胞,三、动物细胞培养方式,悬浮培养 血液、淋巴组织的细胞 贴壁培养 成

6、纤维细胞型（fibroblast） 上皮细胞型(epithilium cell type) 游走细胞型(wondering cell type) 多形性细胞型 (polymorphic cell type) 固定化细胞培养,进行生产的动物细胞培养方式,悬浮培养 瘤细胞、淋巴细胞 贴壁培养 滚瓶培养、玻璃瓶、 塑料瓶 微载体培养 葡萄糖凝胶 固定化细胞培养,.植物组织培养的条件,.概念,贴壁培养,贴壁培养的优点：容易更换培养液；细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的目的；因细胞固定表面，不需过滤系统。 当细胞贴壁于生长基质时，

7、很多细胞将更有效的表达一种产品。同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例。适用于所有类型细胞。 3.贴壁培养的缺点：与悬浮培养法相比扩大培养比较困难，投资大；占地面积大；不能有效监测细胞的生长；,（二）细胞破碎的方法 机械法 物理法 化学法 生物法（酶解）,1.机械法： 1）液体剪切：搅拌、匀浆。 2）固体剪切：研磨，珠磨，捣碎。 2.物理法： 1）超声波破碎法。 2）渗透压突变法：高渗（蔗糖，高盐等） 平衡后迅速转入低渗溶液或水中。 3）冻融法：反复低温冰冻，室温融化。,3. 化学法 应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜结构改变或破坏。 1）有机溶剂处理：破坏膜磷脂结构，常用 丙酮、丁醇、氯

8、仿等。 2）表面活性剂处理：常用非离子型表面 活性剂，如Triton X-100，Tween等。,4.酶解法（enzymatic lysis）： 外加酶法： 根据细胞壁的结构和组成特点，选用适当的酶。 自溶法（autolysis）: 细胞结构在本身具有的各种水解酶作用下发 生溶解的现象。,各种微生物细胞壁的结构与组成,各类微生物细胞用什么酶,革兰氏阳性细菌：溶菌酶作用于肽多糖糖苷键 革兰氏阴性细菌 ：溶菌酶加EDTA 酵母菌 ：葡聚糖酶作用于葡聚糖 霉菌：几丁质酶 植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶,对于阴性菌，除了肽聚糖以外，因为存在脂多糖，必须加入EDTA，这样可以螯合连接相邻脂多糖的

9、Ca、Mg离子，从而破坏脂多糖,（三）细胞破碎确认 1.直接测定破碎前后的细胞数： 破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数； 破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。 2.测定导电率： 利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。 3.测定释放的蛋白质量或酶活力： 测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破碎率。,一、提取方法： （一）盐溶液提取 常用稀盐（常用NaCl）溶液（盐溶），对酶稳定性好、溶解度大 ，最常用。 （二）酸、碱溶液提取 （三）有机溶剂提取,第三节 沉淀分离 根据溶解度的不同,使溶液中的溶质由液相转变为固相析出 实用、简单的初步分离方法，适合于初步提纯使用，不适合酶的精制,

10、生物大分子制备中最常用几种沉淀方法： 中性盐沉淀（盐析法） 有机溶剂沉淀 选择性沉淀（热变性和酸碱变性） 等电点沉淀 有机聚合物沉淀,（一）盐析沉淀法（改变离子强度）,1. 基本原理（盐溶和盐析） 向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种现象： 1) 盐溶（salting in） ： 低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。 2) 盐析（salting out） ： 高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。,（三） 超临界流体萃取 与常规溶剂萃取的区别：将超临界流体作为萃取剂。 超临界流体:温度及压力均处于临界点以上的液体叫超临界流体(supercritical fluid，简称SCF)。处于一种既不

11、同于气态，也不同于液态的新的流体态超临界态. 它是由于液体与气体分界消失，是即使提高压力也不液化的 非凝聚性气体。,SCF性质介于液体和气体之间 ： 1) SCF密度接近于液体，溶解度高。 2) SCF粘度和扩散系数接近于气体， 传质扩散快。,基本过程： 1）在SCF中，溶解度大的物质溶于其中，与不溶解或溶解度小的物质分开。 2）降低压力，使SCF变为气态（密度降低），溶解物质能力下降，萃取物与溶剂分离。,常用超临界液态CO2作为萃取剂， 因为： 1）液体CO2无毒 2）临界温度（304.06K）接近常温 3）临界压力（7.38MPa）较低 4）操作安全,(六) 高效（压）液相层析 （HPLC

12、：High Performance（pressure） Liquid Chromatography ）,特点： 使用的固相支持剂颗粒很细，表面积很大,因而分辨率很高。 溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大。 固定相（柱填料）： 常用坚硬、耐高压，粒度小的硅胶。,颗粒大小对分辨率的影响,流速为240ml/hr,流速对分辨率的影响,颗粒大小为5080目。,洗脱体积（ml）,1. 基本原理 HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达到分离的过程。 许多类型的柱层析都可用HPLC来代替，如离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤等。,2. 分类 按溶质（样品）

13、在两相分离过程的物理化学性质分类： 亲和色谱： 亲和力 吸附色谱： 吸附力 离子交换色谱： 离子交换能力 凝胶色谱： 分子大小而引起的体积排阻 分配色谱： 分配系数,第一节 金属离子置换修饰 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的催化特性发生改变的修饰方法 通过修饰了解各种金属离子在酶催化过程中的作用，阐明催化机制 适用对象：金属酶（metalloenzyme） 一种结合金属的酶，以一个或几个金属离子作为 辅因子 金属离子或是直接参与催化作用，或是对保持酶的活性和构象起稳定作用 金属酶纯化时仍保留着定量 的功能金属离子,第一节 金属离子置换修饰,金属离子置换修饰 常见的金属酶及其离子种

14、类 -淀粉酶 Ca2+、Mg2+、Zn2+ 谷氨酸脱氢酶 Zn2+ 过氧化氢酶 Fe2+ 酰基氨基酸酶 Zn2+ 超氧化物歧化酶 Cu2+、Zn2+ 细胞色素 P450 单加氧酶 Fe2+ 固氮酶 Fe(II)、Mo(IV) 谷胱甘肽过氧化物酶 Se(IV) 主要的金属离子 Ca、Mg、Cu、Zn、Co、 Fe、Mn 等,Cyt P450,1. 酶的提纯 2. 除去原有金属离子 加入金属螯合剂，如 EDTA 等，让酶分子中的金属离子与 EDTA形成螯合物 透析、超滤或层析除去螯合物 3. 加入置换的离子 加入含另一种金属离子的溶液，酶蛋白与其结合 用透析或层析等方法除去未结合的离子,一、金属离

15、子置换修饰的方法,二、金属离子置换修饰的作用,1. 阐明金属离子对酶催化作用的影响 一般在活性中心的金属离子能与底物或辅酶 / 辅基可逆结合，从而起到催化作用 2. 提高酶的催化效率 将 Zn 型-淀粉酶置换成 Ca 型，活力可提高 20%30% 3. 增强酶的稳定性 Fe-SOD 置换成 Mn-SOD 后稳定性增强，对 NaN3 敏感性降低 4. 改变酶的动力学特性 酰化氨基酸水解酶活性部位的 Zn 被 Co 置换后，酶的底物专一性（Km 值）和最适 pH 都显著改变,第三节 侧链基团修饰,采用一定的（化学）方法，使酶蛋白侧链基团发生改变，从而改变酶催化特性的修饰方法 用于研究各种基团在酶分

16、子中的作用及其对酶的结构、特性和功能的影响 荧光试剂修饰侧链，了解酶在水溶液中的构象 各基团对酶结构和活性的影响，研究必需基团的组成 对非催化基团修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的束缚能力 利用侧链修饰测定某种基团在酶分子中的数量 改变酶的结构和催化性能,酶分子修饰的种类,蛋白类酶 侧链基团可组成各种次级键，对蛋白质空间结构的形成和稳定起重要作用，当这些功能基团发生改变，引起次级键改变，使结构发生变化，引起酶特性和功能的改变 亲核性侧链基团：OH、COOH、NH2、SH、咪唑环 亲核性取代的氨基酸残基: Ser、Cys、Asp、Thr、Lys、His 等 亲电性侧链基团：芳香环、吲哚环 亲电性取代的氨基酸残基: Tyr、Trp 核酸类酶 磷酸基，核糖糖环上的OH、碱基杂环及其NH2、OH等,侧链基团修饰几种重要的修饰反应,酰基化 OH（Ser、Thr、Tyr）、SH（Cys）、