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2、，麝脐香）始载于神农本草经，被列为上品。 本草求真：“辛温芳烈，开关利窍。无处不到，如邪气着人淹闭不起，则关窍闭塞，登时眼翻手握。僵仆昏地，故必用此辛香自内达外，则毫毛骨节俱开，而邪始从外出” 本草纲目：“盖麝香走窜，能通诸窍之不利，开经络壅遏。若诸风、诸气、诸血、诸痛、惊痫、癥瘕诸病，经络壅闭，孔窍不利者，安得不用为引导以开之、通之耶？”,麝香,冰片（龙脑，梅片，龙脑香，梅花脑），为龙脑香料植物龙脑香树脂的加工品，始载于新修本草。 味辛苦，微寒无毒，性善走窜，无往不达。 本草纲目：“通诸窍，散郁火。” 本草衍义 “独行则势弱、佐使则有功”。,冰片,醒脑开窍法在中风中的应用,醒脑开窍法介绍 醒
3、脑开窍法为什么可广泛应用于中风 醒脑开窍代表药的实验研究,中风病因病机,积损正衰 饮食不节 情志所伤 外邪入中,病因,风 火 痰 虚 瘀,病机,中风,发病,中经络,中脏腑,闭证,脱证,中风病因病机,水瘀互结 毒损脑络 神窍闭阻,中风病机新观点,意识产生的机制,意识水平开关系统 特异上行投射系统（影响小） 非特异上行投射系统（影响大） 脑干网状上行激活系统 脑干网状上行抑制系统 意识内容大脑皮层的高级活动 记忆、思维、定向、情感、精神、视、听、语言、技巧性运动、复杂反应,上行投射系统,红色：激活通路 黑色：抑制通路,中风病因病机,风,闭,中风之后便无风，风过则凋敝,狭义的闭窍仅指思维、意识、精神
4、状态、认知能力等功能障碍。 广义之“闭窍”则泛指由脑神受损所导致的一切外在生命活动的障碍，中风病无论有无神志障碍均可视为“窍闭神匿、神不导气”。,病因之风、症状之风 病机之风、病名之风,中风病因病机,积损正衰 饮食不节 情志所伤 外邪入中,病因,风 火 痰 虚 瘀,病机,中风,发病,中经络,中脏腑,闭证,脱证,脑窍闭阻,醒脑开窍法在中风中的应用,为什么古代医家认为开窍方药不宜早用和久用？,醒脑开窍法在中风中的应用,醒脑开窍法介绍 醒脑开窍法为什么可广泛应用于中风 醒脑开窍代表药的实验研究,醒脑开窍法在中风中的应用,麝香配伍冰片对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠影响的实验研究,国家自然科学基金项目（编
5、号：300400580） 广东省科技厅项目（编号：2004B33001014）,一:麝香配伍冰片抗大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的疗效观察 大鼠神经功能障碍、脑梗死体积; 脑组织含水量、BBB通透性; 神经元超微结构的改变。,实验研究,二:麝香配伍冰片抗大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的分子机制研究 麝香配伍冰片对脑缺血再灌注后脑水肿相关因子AQP-4 mRNA定量表达的影响 。 麝香配伍冰片对脑缺血再灌注后炎症反应相关因子ICAM-1 mRNA定量表达的影响 。,药物 麝香、冰片悬浊液（每毫升含人工麝香0.1mg，冰片0.3mg）， 用1%吐温80液配成； 麝香悬浊液（每毫升含人工麝香0.1mg），用
6、1%吐温80液配成； 冰片悬浊液（每毫升含冰片0.3mg）；用1%吐温80液配成； 动物分组 给药方法 在造模前3天开始灌胃给药(10ml/kg/d)，每天两次，再于缺血前30min给药一次，缺血后12h与24h各给药一次,假手术组,模型组,麝香配伍 冰片组,麝香组,冰片组,SD大鼠,一、神经功能缺损评分 Bederson氏6级评分标准, 主要通过观察动物的行为变化进行评分。 0分: 没有可见的神经功能缺失； 1分: 左侧前爪不能伸直； 2分: 行走时断续向左侧倾斜划圈； 3分：向左侧持续转圈； 4分: 向左侧倾倒； 5分：不能行走。,观察指标,二、脑梗死体积测定(TTC染色法) 大鼠脑缺血2
7、h再灌注24h后，麻醉后断头处死，迅速取出大鼠大脑; 将大脑置0生理盐水中15min，再取出从额极间隔2mm连续做6个脑组织冠状切片; 置2TTC溶液中，37水浴箱恒温孵育30min; 置10%甲醛中固定24后，数码相机拍照，病理图像分析软件测量梗死灶面积，以梗死灶体积占全脑体积的百分率进行统计分析。,观察指标,假手术组 模型组 麝冰组,结果:,实验三 麝香配伍冰片对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑含水量及血脑屏障通透性影响,脑含水量 干湿重法测定 BBB通透性（Evans-blue检测法） 1、伊文思蓝甲酰胺标准曲线制备 将伊文思蓝5mg溶于10ml的甲酰 胺中,然后梯度稀释成不同浓度; 在紫外分光
8、光度计上测定其吸光度， 测定波长为620nm，以浓度(C)为 横坐标，以吸光度(A)为纵坐标， 求得回归方程: Y=0.0423X+0.0447 (Y为吸光度， X为浓度),2、BBB通透性实验方法： 脑缺血2h 再灌注23h（处死前1小时），从大鼠股静脉注入2%Evansblue生理盐水液(3ml/kg); 1小时后打开胸腔，用生理盐水经左心室灌注，将血管中的伊文思蓝冲洗干净，断头取脑。,取缺血侧大脑皮质，用滤纸吸干表面水分 ，精密称重，并置于含4ml二甲基甲酰胺的试管中，50孵育48h，再离心15min (3000r/min), 取上清液用Hitachi U2001分光光度计测定其吸光度
9、，并由标准曲线方程得出伊文思蓝的浓度（ug/g）。,结果,实验四 麝香配伍冰片对局灶性脑缺血再灌注大鼠 神经元超微结构影响,观察指标： 神经元超微结构变化 神经元突触超微结构变化,假手术组 模型组 麝香配伍冰片组,神经细胞双层核膜 清晰易辨,核较大,核内 染色质无凝聚现象， 胞质内可见较多的 内质网及核旁可见线 粒体， 线粒体形态正常,神经细胞缩小，胞膜、 核膜模糊不清,核内染 色质成团块状。 线粒体 肿胀，粗面内质网 扩张。神经细胞周围 空隙明显增多；,神经细胞双层核膜 结构完整，染色质 无凝聚现象，胞质内 内质网扩张不明显， 小部分线粒体肿胀,1、神经元超微结构变化,麝香组 冰片组,神经细
10、胞相对完整， 核膜尚清楚，染色质 分布均匀，胞质内 内质网扩张，部分 线粒体肿胀,双层核膜结构尚 完整，染色质分布 尚均匀，胞质内可见 内质网扩张，小部分 线粒体肿胀,假手术组：神经细胞的轴突、树突 与胶质细胞旁突相互交织，连结形成 神经毡，神经毡中突触数目众多， 突触前、后膜致密物质厚度对称， 前后界膜分界清楚，轮廓完整， 突触小泡为圆形清亮小泡，大小均等， 密集均匀分布于突触前终末内； 模型组：神经毡内突触减少，结构模糊，前后 界膜不清，突触小泡数量减少甚至消失，典型 的突触结构已遭破坏。神经毡中轴浆电子密度 降低，呈空化透明病变； 麝香配伍冰片组：突触数量较模型组 明显增多，但仍少于正常
11、组，突触形态 大部分接近正常，线粒体数量增多， 仍有少数线粒体呈现肿胀病变，无 轴浆空化表现；,2、神经元突触变化,麝香组：与模型组相近似，轴 浆空化明显，突触数量少，形 态未恢复正常，线粒体数目稍 有增多，部分线粒体形态接 近； 冰片组：正常突触数量较模型组稍 有增多，形态尚未恢复正常，线粒 体数目增多，但肿胀仍存，轴浆空 化病变基本消失；,突触数密度比较,突触数密度比较,实验五 麝香配伍冰片对局灶性脑缺血再灌注大鼠水通道蛋白4(AQP-4)mRNA表达影响,运用实时荧光定量PCR技术（Taqman探针法）定量检测 AQP-4 mRNA的表达 1、Taqman探针、引物设计与合成 2、大鼠脑
12、组织总RNA抽提 3、RT-PCR反应 4、PCR扩增 5、AQP-4 pMD 18-T载体的构建及标准品的制备 6、标准曲线的建立 7、Real Time PCR反应,Taqman探针、引物设计与合成,标准曲线 各组样本荧光 扩增曲线,结果,结果：,实验六 麝香配伍冰片对局灶性脑缺血再灌注大鼠细胞间黏附分子1（ICAM-1）mRNA表达影响,运用实时荧光定量PCR技术（Taqman探针法）定量检测 ICAM-1 mRNA的表达,麝香配伍冰片可减少局灶性脑缺血再灌注大鼠脑梗死体积, 改善脑缺血后神经行为症状。 麝香配伍冰片可有效降低脑缺血再灌注后脑含水量及血脑屏障的通透性，对血脑屏障结构有一定的保护作用。 麝香配伍冰片可有效防止脑缺血再灌注导致的皮质内突触数量的减少，对神经元及神经元突触超微结构有一定的保护作用。 麝香配伍冰片组和冰片组可明显抑制AQP-4 mRNA的表达。 麝香配伍冰片可抑制脑缺血再灌注后ICAM-1的表达，从而抑制脑缺血再灌注时白细胞与内皮细胞间的粘附，减轻缺血性脑损伤。,初步结论,谢谢大家,
