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1、第十九章 药物研究的生物化学基础,第一节 生物药物制造的生物化学基础,一、生物药物制备方法的特点 （1）目的物存在于组成非常复杂的生物材料中 （2）目的物在生物材料中含量极微 （3）生物活性成分离开生物体后，易变性破坏 （4）生物药物制造工艺设计理论性不强 （5）生物制药工艺多采用“逐级分离”法 （6）生物药物的均一性检测与化学上纯度概念不完全相同。,生物药物分离的主要原理：,1. 根据不同组分分配率的差别进行分离 萃取 分配层析 吸附层析 盐析 结晶,2. 根据生物大分子的特性 根据分子形状和分子大小不同： 差速离心、超离心、膜分离透析、超滤、凝胶过滤 根据分子电离性质（带电性）不同： 离子
2、交换法、电泳法、等电聚焦法 根据分子极性大小与溶解度不同： 溶液提取法、逆流分配法、分配层析法、盐析法 根据配基特异性不同 亲和层析法,二、生物合成技术 生物合成是利用生物细胞的代谢反应（更多的是利用微生物转化反应）来合成化学方法难于合成的药物或药物中间体。,微生物转化反应: 是利用微生物的代谢作用来进行某些化学反应，确切地说就是利用微生物代谢过程中某种酶对底物进行催化反应，以生成所需要的活性物质。,半合成药物是指一个药物其部分结构由天然资源得到，然后用化学合成法制得最终产品或应用微生物转化将化学合成的中间产物，通过某些生物合成步骤来解决药物合成中难于进行的化学反应，从而获得最终有效化合物。,
3、三、生物技术,生物技术（biotechnology）又称生物工程（bioengineering），是利用生物有机体（动物、植物和微生物）或其组成部分（包括器官、组织、细胞或细胞器等）发展新产品或新工艺的一种技术体系。,基因工程 细胞工程 酶工程 发酵工程,重组DNA技术（基因工程）基本原理：,（一）目的基因的获取,1. 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 2.基因组DNA文库(genomic DNA library) 3. cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR),（二）基因载体
4、的选用,定义 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。,常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA,载体的选择标准,能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。,质粒 (plasmid),特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。,（三）限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA
5、的一类内切酶。,+,Bam H,Bam H,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,（四）重组体的构建 即外源基因与载体的连接,1. 粘性末端连接 方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 配伍末端连接,Bam H切割反应,T4 DNA连接酶 15C,同一限制酶切位点连接,2. 平端连接 适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端,3. 同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。,载体DNA,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,受体菌条件 安全宿主菌 限制
6、酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent),导入方式 转化 (transformation) 转导 (transduction),（五）重组DNA导入受体菌,（六）重组体的筛选 1. 重组体的表型进行筛选 抗药性标记筛选、营养素的依赖筛选 2. 限制酶切图谱分析鉴定 3.利用核酸杂交技术进行鉴定,(插入失活法) 抗药性标记选择,目 录,组氨酸缺陷 型大肠杆菌,无组氨酸 的培养基,酵母咪唑甘油磷 酸脱水酶基因,促进组氨酸合成,DNA,重组体,标志补救,重组DNA技术操作过程可形象归纳为,小 结,DNA重组技术的主要应用：,1.运用DNA重组技术大量生产基因工程药物。 2.定向改造生物的基因
7、结构，构建高产菌株，用于改造传统制药工业。 3.用于基础研究，用于基因结构与基因组功能的调节研究，用于分子杂交等。,第二节 药物质量控制的生物化学基础,一、药物质量控制的常用生化分析法,（一） 免疫分析法 1. 免疫扩散法 2. 免疫电泳法 3. 放射免疫测定法（RIA）,4. 酶联免疫测定法（ELISA） 就是让抗体或抗原与酶复合物结合，然后通过显色来检测。,（二） 电泳分析法,（三） 酶法分析,1.终止反应法 2.连续测定法 3.循环放大分析法,二、生物药物质量控制的生化分析方法,（一） 多肽与蛋白质类药物的主要分析方法 1. 蛋白质药物的纯度分析 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) SDS-
8、PAGE 毛细管电泳(CE) 等电聚焦(IEF) 高效液相色谱法 (HPLC),2. 多肽与蛋白质分子量的测定 使用较多的是超速离心法，凝胶层析法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法等。,超速离心法,凝胶层析法,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法,3. 蛋白质的定量测定 （1） 物理性质：紫外分光光度法，折射率法， 比浊法。 （2） 化学性质：凯氏定氮法，双缩脲比色法， Folin-酚法，BCA法。 （3） 染色性质：考马斯亮兰G-250结合法、银染、 金染。 （4） 其他：荧光激发。,4.胶体金比色法 胶体金是一种带负电荷的疏水性胶体，加入蛋白质后，红色转变为蓝色，595nm处测定样品的吸收值，计算含量
9、。,5. 生物质谱法： 多肽和蛋白质的分子量可用MALDI/MS（基质辅助激光解吸离子化质谱法）或ESI/MS（电喷雾离子化质谱法）直接测定，用质谱法测定蛋白质的分子量简便，快速、灵敏、准确。,（二） 核酸类药物的主要分析方法,1. 紫外分光光度法 ： 测定RNA与DNA含量260nm 2. 地衣酚显色法测定RNA含量 3，5-二羟甲苯 3. 二苯胺法测定DNA含量,（三） 酶类药物的分析 酶类药物的主要质量指标是它的催化活力。,（四） 重组DNA药物中的可能杂质检查,1. 外源性DNA 2. 宿主细胞蛋白质 3. 二聚体或多聚体的测定 4. 降解产物的测定,第三节 药理学研究的生物化学基础,
10、神经递质,又称突触分泌信号(synaptic signal),特点 由神经元细胞分泌； 通过突触间隙到达下一个神经细胞； 作用时间较短。,例如： 乙酰胆碱、去甲肾上腺素等,一、药物作用的生物化学基础 （一）神经传导与神经递质,乙酰胆碱受体功能模式图,1.受体-离子 通道型,（二）受体的结构与功能, G蛋白(guanylate binding protein),是一类和GTP或GDP相结合、位于细胞膜胞浆面的外周蛋白，由、 三个亚基组成。 有两种构象：非活化型；活化型,2受体-G蛋白-效应蛋白型,R,H,AC,GDP,GTP,腺苷酸环化酶,AC,ATP,cAMP,与配体结合后具有酪氨酸蛋白激酶活
11、性，如胰岛素受体insulin growth factor receptor, IGF-R 表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGF-R)。,4受体-转录因子型,高度可变区,位于N端，具有转录活性,DNA结合区,含有锌指结构,激素结合区,位于C端，结合激素、热休克蛋白，使受体二聚化，激活转录,铰链区,（三）跨膜信号转导与细胞内信号转导 （1）不同种类的受体使用由共同组分构成的转导信号 （2）在信号转导通路中不同类型的磷酸化同时起作用,（四）细胞信号转导与药物研究,信号转导分子的激动剂和抑制剂是信号转导药物的研究出发点，尤其是各种蛋白激酶的抑制
12、剂更是被广泛用做母体药物进行抗肿瘤新药。,信号转导干扰药物的药效和副作用 取决于：,一、它所干扰的信号转导途径在体内是否广泛存在，如果广泛存在各细胞内，副作用难以控制。 二、药物自身的选择性，对信号转导分子的选择性越高，副作用越小。,（五）药物作用的靶酶 药物对靶酶的作用： 调节酶量 调节酶活力,酶抑制剂应用临床的条件：,（1）被抑制的靶酶所催化的生化反应与某种疾 病的发生有关，具有治疗作用。 （2）酶抑制剂具有特异性。 （3）具有某种药动学特征，能到达作用部位、具有合理、可预见的量效关系和作用持续时间。 （4）对人体毒性小，疗效指数高。 （5）应符合药品标准。,（六）细胞生长调节因子 1.细
13、胞生长刺激因子类 2.细胞生长抑制因子类,（七）细胞凋亡的生物化学,细胞凋亡是某些生理或病理条件下，细胞接受到某种信号所触发的并按一定程序进行的主动、缓慢的死亡过程。,生化特征： （1）DNA片段化 （2）谷氨酰胺转移酶、钙蛋白酶激活： 如磷脂酰丝氨酸显露 （3）一些特殊蛋白质、RNA的产生和合成,二、新药筛选的生物化学方法,（一）放射配基受体结合法（RRA）,（二）酶学实验法 肝脏细胞色素P450系统,（三）膜功能研究方法 1.钙调蛋白-红细胞膜的制备及钙调蛋白功能测定 2.心肌细胞膜的制备与功能测定,（四）生化代谢功能分析法 1.降血糖药物实验法 2.调血脂药及抗动脉粥样硬化药实验法 3.
14、凝血药和抗凝血药实验法,（五）逆向药理学 基因受体药物,一、酶与药物设计 二、受体与药物设计 （一）受体介导的靶向药物设计 （二）药物与受体结合的构象分析 1同源分子法 2归纳法 3演绎法 4比较分子力场分析法,第四节 与药物设计有关的生物化学原理,三、药物代谢转化与前体药物设计,研究药物代谢的主要目的是确定药物在体内转化的途径，并定量地确定每一代谢途径及其中间体的药理活性。,四、生物大分子的结构模拟与药物设计,生物大分子结构模拟的药物设计有两个热点： 1应用蛋白质工程技术改造具有明显生物功能的天然蛋白质分子，以蛋白质的结构规律及其生物功能为基础，通过分子设计和有控制的基因修饰以及基因合成对现
15、有蛋白质加以定向改造，构建最终性能比天然蛋白质更加符合人类需要的新型活性蛋白。,2基于生物大分子的结构知识进行的药物设计。,五、药物基因组学与药物研究,药物基因组学（Pharmacogenomics）是研究影响药物作用，药物吸收、转运、代谢、清除等基因差异的学科即决定药物作用行为和作用敏感性的相关基因组科学，它是以提高药物疗效与安全性为目的，对临床用药具有重要指导作用。,药物基因组学在药学的应用：,（1）检测、评估个体对某种药物的适用程度， 使药物的有效性达到最大化。 （2）检测药物应答基因的多态性，依据个体的 遗传差异实现差异个性化用药。 （3）确定疾病发生相关基因，筛选新的药物作用靶 点。 （4）研究药物代谢酶基因谱及药物产生毒副反应的相 关基因，提高新药开发命中率，增强药物疗效和 安全性，缩短开发周期，降低研究开发成本。,六、系统生物学与药物发现研究,系统生物学是一门假说驱动（hypothesis-drive）的科学，是利用基因组学，蛋白质组学、转录组学及其他多种组学技术综合获得的全球性数据进行定量的、综合的、动态的研究学科。,系统生物学是解决药物发现研究中所遇到的一些挑战性问题的有效途径： （1）加速药物的发现和开发过程。 （2）药物作用靶点的发现与确证。 （3）发现代表性标志物。 （4）建立个性化用药方案。,
